Pour commencer, disposez le matériel expérimental requis sur la plate-forme de travail. Ajoutez 100 microlitres de solution de gélatine stérile à 0,4 % dans les puits d’une plaque inférieure transparente à parois noires de 96 puits. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.
Au microscope inversé, confirmez que les cellules endothéliales d’un ballon T75 sont confluentes à 80 à 100 %. Retirer le milieu complet DMEM de la fiole par aspiration. Pour laver les cellules, ajoutez 10 millilitres de PBS et secouez doucement le flacon.
Remplacez le PBS par cinq millilitres de solution de dissociation cellulaire. Incuber le ballon à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant environ 12 minutes. Tapotez le flacon au bout de six minutes.
Pour aider à faciliter la dissociation. Ajoutez cinq millilitres de milieu complet DMEM préchauffé dans la fiole et mélangez la suspension cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, transvaser la suspension cellulaire dans un tube stérile de 50 millilitres et centrifuger à 150 G pendant cinq minutes.
Pendant ce temps, à l’aide d’une pipette pasteure reliée à un vide, aspirez la solution de gélatine de la plaque à 96 puits. Après centrifugation des cellules, retirez la supernatine du tube sans déranger la pastille. À l’aide d’une pipette sérologique, ajoutez huit millilitres de milieu complet DMEM frais dans le tube et pipetez doucement la suspension pour briser la pastille cellulaire.
Comptez les cellules à l’aide du trippen blue sur un hémocytomètre. Ajouter un milieu complet DMEM pour obtenir une densité de 600 000 cellules par millilitre de suspension. Mélangez la suspension cellulaire en inversant doucement le tube.
Ajoutez la suspension cellulaire dans un réservoir de pipette multicanaux de 50 millilitres. Toutes les 30 secondes, secouez doucement le réservoir d’un côté à l’autre pour mélanger la suspension et utilisez une pipette multicanaux pour ajouter 100 microlitres à chaque puits de la plaque de 96 puits recouverte de gélatine. Replacez le couvercle transparent de la plaque et secouez doucement la plaque en la faisant glisser sur la surface de la hotte stérile du nord au sud et d’est en ouest.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 16 à 24 heures.
