Après avoir cultivé des cellules endothéliales dans la plaque à 96 puits, retirez-la de l’incubateur et confirmez la confluence à l’aide d’un microscope inversé. Jetez l’assiette dans un évier pour retirer tout le support et épongez le haut de l’assiette avec une serviette en papier. Ajouter le tampon de dosage HBSS HEPES et la solution de probénécide dans un réservoir de solvant de pipette multicanaux de 50 millilitres.
À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de tampon de dosage dans chaque puits et laissez les cellules reposer pendant cinq minutes. Ensuite, agitez la plaque pour retirer le tampon de dosage. Ajoutez le tampon de téléchargement dans un réservoir de solvant de pipette multicanaux séparé de 50 millilitres.
À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 50 microlitres de tampon de chargement de colorant dans chaque puits de la plaque de dosage. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 45 minutes. Après l’incubation, observez la plaque sous un microscope à fluorescence pour confirmer l’absorption du colorant.
Retournez la plaque pour retirer la solution de colorant. Lavez les cellules deux fois avec 50 microlitres de tampon de dosage HBSS HEPES plus une solution de probénécide dans chaque puits. Agissez la plaque pour retirer le tampon de dosage.
Ajoutez 92 microlitres de tampon de dosage HBSS HEPES dans chaque puits, et encore une fois, observez les cellules avec un microscope à fluorescence pour vous assurer que l’excès de colorant a été complètement éliminé et que les cellules restent adhérentes. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter deux microlitres de solutions antagonistes et de véhicule dans les puits appropriés. Après avoir allumé le lecteur de plaques, réglez la température à 37 degrés Celsius et incubez la plaque pendant 15 minutes.
Mesurez la fluorescence de fond dans les colonnes un et deux, en effectuant cinq balayages par puits. Éjectez la plaque du lecteur de plaques, puis d’une bandelette PCR de 8 tubes, ajoutez rapidement six microlitres de solution agoniste à l’aide d’une pipette multicanaux dans chaque puits des colonnes un et deux. Mesurez le changement de fluorescence lorsque la mobilisation du calcium se produit dans les cellules.
Effectuez 20 balayages de chaque puits. Le test de mobilisation du calcium avec des cellules endothéliales a montré que les puits de contrôle positifs sans antagoniste présentaient une augmentation rapide de la fluorescence. Les puits avec des concentrations élevées d’antagonistes ont montré un changement minime de la fluorescence, similaire aux puits témoins négatifs sans agoniste.
