Injectez un à trois milligrammes d’anticorps anti-souris CD45 conjugué au fluorophore dilué dans 100 millilitres de solution saline normale par voie intraveineuse dans chaque souris anesthésiée. Commencez par placer quatre millilitres de tampon HEPES glacé préparé dans un tube de dissociation tissulaire spécialisé sur de la glace pour chaque souris. Après avoir euthanasié la souris, placez les poumons réséqués dans leur tube de dissociation tissulaire respectif, refroidis sur de la glace.
Placez les tubes sur le dissociateur de tissu automatisé et exécutez le premier programme prédéfini pour le tissu pulmonaire. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution mère de libérase et 500 microlitres de solution mère d’aminoguanidine dans chaque tube contenant le tissu pulmonaire dissocié. Incuber sur un mélangeur à noix pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Ensuite, replacez les tubes sur le dissociateur et exécutez le deuxième programme prédéfini pour le tissu pulmonaire. Versez maintenant la suspension unicellulaire du tube de dissociation tissulaire à travers une passoire de cellules de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez le tube de dissociation tissulaire avec cinq millilitres d’EHAA complet et passez à travers la passoire dans le tube de 50 millilitres.
Après avoir retiré la crépine, augmentez le volume de la suspension cellulaire à 50 millilitres avec EHAA complet. Au lieu d’utiliser des tubes de dissociation tissulaire spécialisés, placez les poumons réséqués dans leurs tubes de microfuge respectifs de 1,5 millilitre refroidis sur de la glace. Une fois que tous les poumons ont été prélevés, transférez chaque poumon dans un tube de microfuge frais sans aucun milieu cellulaire.
À l’aide de ciseaux, coupez les poumons en petits fragments à l’intérieur du tube de microfuge. Ajoutez un millilitre de cocktail de digestion liberase TM et DNase I dans chaque tube. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.
Ensuite, versez l’échantillon sur une passoire de 100 micromètres placée sur un tube conique de 50 millilitres. Pipeter le reste de l’échantillon sur la passoire. Écrasez le tissu contre le grillage avec l’extrémité en caoutchouc du piston à partir d’une seringue stérile d’un millilitre.
Rincez la passoire avec un tampon de tri à froid, en recueillant un volume final de sept millilitres dans le tube. Que ce soit en utilisant la méthode de dissociation automatisée ou manuelle, centrifugez la suspension cellulaire obtenue. Aspirez soigneusement le surnageant, en laissant derrière vous environ 100 microlitres de surnageant et la pastille cellulaire.
Enfin, ajoutez environ 100 microlitres de solution de bloc Fc pour porter le volume total à 200 microlitres et tourbillonnez vigoureusement pour remettre le granulé en suspension.
