Pour commencer, ajoutez 50 microlitres de microbilles CD90.2 anti-souris aux cellules pulmonaires isolées. Après avoir tourbillonné le mélange, incubez-le pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, placez une colonne de séparation de cellules paramagnétique sur un aimant de séparation de cellules à une ou quatre positions.
Placez un tube conique ouvert de 15 millilitres sous chaque colonne pour capter le débit. Amorcez la colonne avec trois millilitres de tampon de tri à froid, permettant à la colonne de s’écouler par gravité dans le tube conique situé en dessous. Une fois que les cellules ont incubé avec les microbilles pendant 10 minutes, ajoutez un tampon de tri à froid à un volume d’un millilitre et transférez le mélange à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres placée au sommet de la colonne.
Recueillir le flux de colonne dans un nouveau tube conique de 15 millilitres placé sous la colonne. Une fois que la suspension de la cellule s’est complètement écoulée à travers la colonne, ajoutez trois millilitres supplémentaires de tampon de tri à froid dans le tube d’origine et appliquez-le sur la colonne à travers le grillage avant de retirer la passoire. Lorsque l’échantillon s’est complètement écoulé dans la colonne et qu’il n’y a plus d’écoulement qui s’écoule, retirez la colonne de l’aimant et placez-la au sommet d’un tube conique frais de 15 millilitres.
Ajoutez cinq millilitres de tampon de tri à froid dans la colonne. Pour éluer les cellules liées, poussez le piston de la colonne vers le bas en un mouvement continu, forçant le tampon à sortir du fond dans un nouveau tube. Centrifuger les échantillons élués à 400 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirez soigneusement le surnageant, en laissant environ 100 microlitres de surnageant et la pastille cellulaire. En moyenne, le processus d’enrichissement permet de récupérer plus de 99 % de tous les lymphocytes T CD90.2 positifs des poumons dont la pureté est supérieure à 90 %.
