Pour isoler les cellules souches neurologiques ou NSC des zones sous-ventriculaires neuronales disséquées, coupez chaque SVZ en quatre à cinq petits morceaux pour faciliter la désagrégation du tissu. À l’aide d’une pipette pasteur en plastique stérile, transférez les SVZ hachés dans un tube à centrifuger de 15 millilitres tout en veillant à ce qu’aucun fragment ne reste dans la plaque. Laissez le tissu sédimenter au fond du tube avant de retirer le DPBS restant.
Ajoutez 500 microlitres de mélange enzymatique filtré pour les deux SVZ par cerveau, et incubez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez cinq millilitres de milieu témoin pré-averti à 37 degrés Celsius à chaque échantillon. Centrifuger l’échantillon à 300 G pendant cinq minutes.
Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une micro-pipette ou d’une pompe à vide. À l’aide d’une pipette en verre de pâturage poli au feu, ajoutez un millilitre de milieu témoin à la pastille. Désagréger mécaniquement soigneusement la pastille en pipetant 10 à 20 fois de haut en bas jusqu’à l’obtention d’une suspension cellulaire homogène.
Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu de contrôle, et mélangez par inversion pour laver les cellules. Après une centrifugation à 300 G pendant cinq minutes, remettre uniformément en suspension la pastille obtenue dans un millilitre de milieu complet en pipetant 10 fois de haut en bas. Après avoir dilué une partie d’une aliquote de la suspension cellulaire avec une partie de bleu de trypan, comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer sous le microscope.
Assurer la désagrégation cellulaire au niveau de la cellule unique avant d’ensemencer les cellules de manière égale dans huit puits d’une plaque de 48 puits dans un volume final de 500 microlitres de milieu complet. Incuber les cellules pendant cinq à sept jours pour laisser les neurosphères primaires se former.
