Pour commencer, ajoutez 1,5 millilitre d’éthanol à 70 % à 30 milligrammes de particules de tungstène de 0,7 micromètre dans un microtube. Centrifugez le mélange à 13, 200G pendant 15 minutes. Ajoutez 1,5 millilitre d’eau stérile aux particules, puis utilisez un vortex et centrifugez à nouveau.
Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 500 microlitres de glycérol stérile à 50 % aux particules de tungstène. Pour enrober les particules, ajoutez d’abord cinq microgrammes d’un plasmide de deux microns et 15 microgrammes d’un plasmide bactérien contenant la séquence mitochondriale dans un microtube placé sur de la glace. Ajoutez 100 microlitres de suspension de particules de tungstène dans le tube et le vortex.
Ajoutez ensuite quatre microlitres de spermidine à une molaire et vortex à nouveau. Maintenant, pipetez 100 microlitres de chlorure de calcium 2,5 molaires glacé dans le tube. Après avoir brièvement fait tourbillonner la suspension, incubez-la sur de la glace pendant 10 minutes.
Centrifugez les particules de tungstène à 13, 200G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les particules dans 200 microlitres d’éthanol à moins 20 degrés Celsius. Enfin, remettez en suspension les particules de tungstène dans 60 à 70 microlitres d’éthanol à température ambiante.
Pour préparer le matériel biolistique, placez six supports de macroporteurs stérilisés sur une plaque de verre stérile. À l’aide d’une paire de pinces stériles, insérez les macroporteurs dans chacun des six supports de macrotransporteurs. Pipetez 10 microlitres de particules de tungstène codées en ADN sur chaque surface de macrosupport et répartissez-les uniformément sur toute la surface avec la pointe de la pipette.
Inoculez la souche du récepteur de levure rho zero dans deux millilitres de milieu YPR. Cultivez la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius dans une roue rotative. Le lendemain, transférez 300 microlitres de la culture dans un tube contenant 30 millilitres de milieu YPR frais.
Placez la culture sur un agitateur rotatif pendant deux nuits à 30 degrés Celsius et 200 tours par minute jusqu’à ce que la culture soit saturée. Centrifugez les cellules de levure à 600G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans 600 microlitres de milieu YPD après avoir jeté le surnageant.
Utilisez maintenant une poignée en verre stérile pour étaler 100 microlitres de suspension de cellules de levure sur une plaque de support de bombardement solide. Après avoir étalé toutes les cultures, incubez les plaques à température ambiante pendant une à trois heures avant de les bombarder.
