Pour commencer, à l’aide d’une pipette, repérez cinq microlitres de chaque extrait à deux centimètres de distance sur les points marqués sur la ligne inférieure de la plaque de chromatographie sur couche mince, ou CCM. Laissez sécher les taches sur la plaque TLC et répétez l’opération jusqu’à ce qu’environ cinq milligrammes de chaque extrait soient chargés sur la plaque. Préparez une solution 1:2 de dichlorométhane et de méthanol dans un réservoir de développement de CCM.
Placez la plaque TLC dans le réservoir de développement et développez-la, jusqu’à ce que le solvant atteigne la ligne marquée à deux centimètres du haut de la plaque. Une fois développée, retirez la plaque TLC du réservoir. Repérez immédiatement les commandes positives sur les points au-dessus de la ligne de solvant.
Placez la plaque dans une boîte de plaque TLC stérilisée à l’éthanol avant que tout le solvant ne s’évapore. Grattez le tapis mycélien des cinq plaques d’agents pathogènes à l’aide d’une spatule métallique stérile. Ensuite, transférez-le dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.
Après avoir ajouté 25 millilitres de bouillon de dextrose de pomme de terre amendé à l’agar-agar, ajoutez des billes de verre stériles dans le tube et agitez pendant cinq minutes pour briser le tapis mycélien. Après avoir assemblé le pulvérisateur de chromatographie dans le capot, fixez le tube. Ensuite, fixez le débitmètre à la configuration.
Transférez la suspension mycélienne dans le pulvérisateur de chromatographie à l’aide d’une seringue stérile avec une pointe d’aiguille pour vous assurer que de gros morceaux de mycélium n’obstruent pas le pulvérisateur. Placez les plaques TLC précédemment développées sur des serviettes en papier stériles dans la hotte à flux laminaire pour réduire le contact des mains avec la plaque, tout en appliquant la suspension du support. Connectez l’échantillon d’agent pathogène au pulvérisateur assemblé et appliquez trois couches de suspension sur la plaque TLC, permettant à la plaque de sécher complètement entre les applications.
Ensuite, préparez la configuration d’incubation en ajoutant 50 millilitres d’eau stérile dans une boîte à plaques en plastique stérilisé. Placez-y quatre plaques de Pétri pour que la plaque TLC puisse s’y asseoir. Placez également des feuilles de cellulose pliées stérilisées ou du papier filtre de chaque côté de la boîte pour retenir l’humidité.
Placez la plaque de test terminée sur quatre boîtes de Pétri vides dans la boîte. Incuber le test pendant trois jours à une semaine ou jusqu’à ce qu’une couche uniforme de mycélium se développe sur la plaque, à l’exception des témoins positifs et de la zone d’inhibition. Ensuite, à l’aide d’une cuillère en métal, grattez la silice des zones d’inhibition et placez-la dans des tubes de microcentrifugation.
Ajoutez 500 microlitres de méthanol dans chaque tube et vortex pour extraire les métabolites de la silice. Centrifuger les tubes pour granuler la silice et transférer le surnageant dans des flacons de chromatographie liquide pour analyse. L’imagerie sous lumière ultraviolette a montré la séparation des métabolites sur la plaque TLC.
Après l’incubation, l’agent pathogène a semblé se développer uniformément sur toute la plaque, sauf sur les témoins positifs et les zones d’inhibition.
