Pour commencer, préparez une suspension de cellule unique splénique de souris avec une fois 10 à la puissance huit cellules par millilitre dans un volume de 0,1 à deux millilitres. Ajoutez 50 microlitres de sérum de rat à l’échantillon. Transférez l’échantillon dans un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres.
Ajoutez 50 microlitres de cocktail d’isolement à l’échantillon. Bien mélanger et incuber pendant 7,5 minutes à température ambiante. Ajoutez maintenant 50 microlitres par millilitre de cocktail d’épuisement.
Bien mélanger et incuber pendant 2,5 minutes. Pendant ce temps, vortex les billes magnétiques pour assurer une dispersion uniforme. Ajoutez 75 microlitres de billes magnétiques à l’échantillon.
Bien mélanger et incuber pendant 2,5 minutes. Complétez l’échantillon avec du RPMI 1640 medium jusqu’à un volume final de 2,5 millilitres et mélangez plusieurs fois. Placez ensuite le tube dans l’aimant pendant 2,5 minutes.
Prenez l’aimant et retournez-le avec le tube en un mouvement continu, en versant la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Effectuer une analyse cytométrique en flux pour les lymphocytes T naïfs positifs à la maladie de Crohn quatre avant et après l’isolement.
Après la gating, transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger. Centrifugez à 400G pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 200 à 500 microlitres de milieu RPMI 1640 complété par 10%FBS.
Pour chaque millilitre de culture cellulaire, ajoutez deux microlitres de cocktail d’activation leucocytaire et mélangez. Cultivez les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius avec une humidité saturée pendant quatre à six heures.
