Pour commencer, placez une fiole de cellules mononucléées de sang périphérique humain cryoconservées dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois décongelée, transférez la suspension PBMC dans un tube de 15 millilitres contenant neuf millilitres de TGM. Centrifuger le tube à 300 G pendant cinq minutes après avoir pipeté une aliquote de la suspension cellulaire pour le comptage.
Remettre en suspension le PBMC granulé dans trois millilitres de TGM. Ensuite, transférez le volume requis de suspension cellulaire dans une plaque à six puits. La veille de la réanimation cellulaire, transférez 100 microlitres de billes magnétiques d’immunoglobuline G de souris dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Ajoutez un millilitre de PBS dans les tubes et placez-les sur un support magnétique pour laver les billes. Remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite les anticorps à la suspension.
À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement la suspension. Placez la suspension sur un rocker à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir lavé les billes dans du PBS comme fait précédemment, mettez-les en suspension dans 100 microlitres de PBS.
Ajoutez maintenant des billes d’immuno recouvertes de NHCD3 hCD28 dans la plaque et incuberez. Après 48 heures d’incubation, mélangez et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Placez le tube sur un support magnétique pendant trois minutes.
Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres. Semez cinq fois 10 à la puissance cinq PBMC dans 300 microlitres de TGM dans les puits d’une plaque plate de 48 puits. Pipette 200 microlitres de stock lentiviral dans les puits correspondants.
Ajoutez ensuite du sulfate de protamine à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre avant la centrifugation. Pipetez 300 microlitres de surnageant dans chaque puits, puis ajoutez un millilitre de TGM frais dans chaque puits. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone.
Ajoutez de 0,5 à deux millilitres de TGM frais dans l’assiette tous les deux à trois jours. Transférez ensuite les cellules dans une plaque à 12 puits, suivie d’une plaque à six puits jusqu’à ce que la densité cellulaire totale atteigne 6 millions dans un volume de quatre millilitres.
