Pour commencer, placez les cellules T cultivées transduites par le CAR dans deux plaques à 12 puits contenant deux millilitres de TGM. Placez une assiette directement dans un incubateur humidifié à moins de 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Placez l’autre plaque dans une chambre d’incubation mobile de dioxyde de carbone et d’azote d’oxygène avec le niveau d’oxygène préréglé à 1 %Collectez 500 000 cellules des plaques toutes les 24 heures dans les deux conditions dans des micro-tubes à centrifuger de 1,5 millilitre.
Centrifugez les tubes à 500 G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, pipetez doucement un millilitre de PBS dans la pastille cellulaire. Remettre en suspension les cellules granulées dans 50 microlitres de tampon FACS.
Ajoutez ensuite 50 microlitres d’une dilution de un à 100 d’anticorps anti-drapeau conjugué à la phycoérythrine. Pipetez la suspension pour bien mélanger. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de tampon FACS dans chaque tube.
Centrifuger la suspension mixte à 500 G pendant cinq minutes. Maintenant, pipetez les surnageants de chaque tube. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon FACS.
Transférez la suspension cellulaire résultante dans des tubes de cytométrie en flux de cinq millilitres. Effectuer une cytométrie en flux sur la suspension cellulaire pour déterminer l’expression du récepteur de l’antigène chimérique de surface. Configurez les nouveaux tubes en tant qu’ébauche et VOITURE.
Cliquez sur les canaux FSCA, FSCH, SSCA, SSCH, PE et FITC. Créez ensuite quatre diagrammes de dispersion pour identifier séquentiellement les cellules individuelles, les cellules vivantes, les cellules GFP positives et les cellules PE positives. Définissez les paramètres de collecte de 10 000 cellules vivantes uniques.
Cliquez sur Acquérir des données. Une fois que la collecte de cellules est stable, cliquez sur Enregistrer les données. Pour déterminer l’emplacement des portes en fonction du contrôle négatif, contrôlez les cellules positives pour l’EGFP et la phycoérythrine afin de mesurer la positivité de la phycoérythrine et l’intensité médiane de la fluorescence.
Les cellules sensibles à l’hypoxie par deux ciblant les CAR ont montré des expressions significativement élevées de CAR dans des conditions hypoxiques par rapport aux conditions normoxiques.
