Pour commencer, ensemencez 1000 cellules cibles dans chaque puits de deux plaques de culture tissulaire à fond plat de 96 puits contenant 200 microlitres de FBSDMEM. Le lendemain, pipetez soigneusement 100 microlitres de surnageant par le haut de chaque puits. Ajoutez des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique ou des lymphocytes T non transduits dans 100 microlitres de FBSDMEM à différents ratios.
Placez une plaque dans une atmosphère à 21 % d’oxygène et l’autre dans une chambre d’incubation mobile de dioxyde de carbone et d’azote sous une atmosphère à 1 % d’oxygène. Après 24 heures de co-culture, à l’aide d’une pipette, transférez soigneusement tout le surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits à fond en U. Stockez le surnageant à moins 20 degrés Celsius pour la détection des cytokines.
Ajoutez maintenant 60 microlitres de tampon de lyse passive dans chaque puits expérimental des plaques noires à 96 puits à fond plat. Placez les plaques sur un agitateur pendant 30 minutes pour assurer une lyse cellulaire efficace. Ajoutez 60 microlitres de substrat de luciférase dans chaque puits expérimental.
Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer immédiatement l’activité de la luciférase. Enfin, calculez le pourcentage de cytotoxicité normalisé à l’aide de l’équation donnée. Le CAR HER2 sensible à l’hypoxie a été capable de tuer efficacement les cellules cibles, que l’atmosphère soit hypoxique ou normoxique.
En revanche, les cellules CAR-T HER2-BBz-ODD ont montré une cytotoxicité significativement plus faible dans des conditions normoxiques pour toutes les conditions.
