Pour commencer, obtenez une tranche de tissu pulmonaire de souris incrustée de paraffine et placez-la dans un four à 65 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pour la coloration, immergez la lame avec la section de tissu séquentiellement dans les bocaux de coloration contenant les solutions appropriées. Diluez la solution modifiée de récupération de l’antigène du citrate de sodium 50 fois avec de l’eau désionisée.
Après avoir préchauffé l’extrait d’antigène au micro-ondes à puissance élevée, placez-y la lame pendant 15 minutes à ébullition. Une fois que la diapositive a refroidi à température ambiante, lavez-la deux fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Perméabilisez ensuite le tissu avec 0,25% triton deux fois pendant 10 minutes chacune.
Encerclez le tissu avec un stylo d’immunohistochimie et incubez la lame avec 5 % de BSA à température ambiante pendant une heure. Ensuite, diluez l’isolectine B4, ou IB4, avec 1 % de BSA dans un rapport de 1 à 50. Après avoir éliminé l’excès d’eau, incubez la section de tissu avec 50 à 100 microlitres de l’IB4 dilué pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Lavez les lames trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune et perméabilisez avec 0,25 % de triton pendant 10 minutes. Incuber ensuite la section de tissu avec 50 à 100 microlitres de DAPI à température ambiante pendant cinq minutes. Après trois lavages PBS, appliquez une goutte de support de montage anti-décoloration sur la diapositive, en évitant l’exposition à la lumière.
Montez la lame séchée à l’air sous un microscope à fluorescence pour capturer des images du noyau et des signaux cibles. Ce protocole permet de localiser et d’observer avec précision la microvascularisation pulmonaire à l’aide d’IB4 pour colorer les cellules micro-endothéliales de différents lobes pulmonaires de souris au microscope à fluorescence.
