Pour commencer, prélevez des coupes de tissus pulmonaires de souris à l’isolectine B4 ou à l’IB4 et au DAPI. Acquérez des images sous un microscope à fluorescence avec un objectif 10x. Importez les images dans le logiciel ImageJ et sélectionnez-les.
Divisez les canaux en conséquence et chargez le fichier au format ND2 pour les canaux DAPI et IB4. Accédez à Analyser, définir l’échelle. Configurez les paramètres de l’image, puis sélectionnez Global, puis OK.To définissez la même plage d’affichage, accédez à Image, ajustez le contraste de luminosité, puis cliquez sur Définir.
Réglez la plage d’affichage pour IB4 de zéro à 10 000, et celle pour DAPI de zéro à 20 000. Pour éliminer l’arrière-plan, cliquez sur Traiter, puis sur mathématiques. Soustrayez le signal d’arrière-plan en fonction des valeurs détectées par l’outil baguette magique en arrière-plan.
Pour sélectionner la meilleure valeur de seuil, accédez à Image et cliquez sur Dupliquer. Sélectionnez le type d’image d’origine et Dupliqué sur 8 bits. Ensuite, sous l’onglet Image, sélectionnez Ajuster, puis Seuil et Entrer en modes.
Après avoir choisi le seuil le plus réaliste, sélectionnez Fond sombre et appliquez. À l’aide de l’outil de la baguette magique, sélectionnez des vaisseaux sanguins plus grands par rapport à l’image dupliquée, puis cliquez sur Supprimer pour éliminer les signaux IB4 positifs des grosses artères et veines. Pour compter le nombre de signaux cibles, cliquez sur Analyser, puis sur Définir les mesures, puis cochez Zone, Limiter au seuil et Afficher l’étiquette.
Sélectionnez ensuite Analyser les particules et modifiez la valeur de zéro à l’infini, la valeur de zéro à un et l’option Afficher en tant que masques de superposition. Cochez Résumer, puis cliquez sur OK. Enfin, choisissez Résumé. Cliquez sur Fichier et enregistrez les résultats.
Le pourcentage de foyers IB4 positifs dans les lobes crâniens, moyens, caudaux, accessoires et pulmonaires gauches a pu être distingué entre les souris jeunes et les souris d’âge moyen à l’aide de l’analyse ImageJ.
