Après l’étalonnage du système de respirométrie, remplacez le MiR05 de chaque chambre par 2,1 millilitres de solution MiR05 fraîche. Dans le logiciel de respirométrie, entrez les paramètres de l’instrument. Définissez le nom du fichier et enregistrez les paramètres.
Dans la boîte de dialogue suivante, entrez les informations sur l’échantillon, y compris le poids de chaque échantillon ajouté à chaque chambre. Maintenant, ouvrez la fenêtre d’étalonnage de l’oxygène, cliquez sur copier à partir du fichier et sélectionnez le fichier d’étalonnage de l’air enregistré. Ensuite, cliquez sur le bouton calibrer et copier dans le presse-papiers.
À l’aide de pinces fines, transférez soigneusement les faisceaux de fibres musculaires, préalablement isolés de la souris, dans la solution de respiration. Placez les bouchons sur la chambre et poussez-les à mi-chemin vers le bas pour fermer à moitié la chambre. Une fois que les joints toriques des bouchons s’engagent avec la paroi de la chambre, utilisez un mouvement de torsion tout en poussant vers le bas pour fermer.
Lorsque la chambre est à moitié fermée, une petite bulle d’air est observée au sommet de la chambre. Remplissez une seringue en plastique de 10 millilitres avec de l’oxygène pur provenant d’une bouteille d’oxygène. Placez l’aiguille longue et émoussée sur la seringue, puis insérez l’aiguille dans la première chambre et délivrez lentement environ un millilitre d’oxygène.
Surveillez la concentration d’oxygène dans la chambre. Lorsque la concentration atteint 350 à 400 nanomoles par millilitre, tournez doucement le bouchon tout en poussant vers le bas pour fermer complètement la chambre. Observez la chambre et assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles d’air.
Pour normaliser les données de flux d’oxygène en fonction de la masse de tissu à partir du menu de mise en page, sélectionnez la disposition de la mise en page 06 flux spécifique par unité d’échantillon. Assurez-vous que la concentration et le flux d’oxygène se sont stabilisés après l’ajout d’oxygène pour commencer la mesure de la respiration. À l’aide d’une seringue en verre de 10 microlitres, ajoutez 2,5 microlitres de malate de 0,8 molaire dans chaque chambre.
Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec M.Enregistrez un flux d’oxygène stable pendant une à deux minutes. Pour la glycolyse aérobie, ajoutez 10 microlitres de glutamate à deux molaires et cinq microlitres de pyruvate à deux molaires dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec GP. Enregistrez un flux d’oxygène stable pendant une à deux minutes.
Ajoutez 10 microlitres de glutamate 2 molaires et 10 microlitres de palmitoylcarnitine 10 millimolaires dans chaque chambre pour substrats d’acides gras. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec GPC. Enregistrez un flux d’oxygène stable pendant une à deux minutes.
À l’aide d’une seringue en verre de 25 microlitres, ajoutez 20 microlitres d’ADP 0,5 molaire dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec ADP. Enregistrez un flux d’oxygène stable pendant une à deux minutes.
Maintenant, ajoutez 20 microlitres d’une molaire succinate dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec S.Enregistrez un flux d’oxygène stable pendant une à deux minutes. À l’aide d’une seringue en verre de 10 microlitres, ajoutez cinq microlitres de cytochrome c millimolaire dans chaque chambre.
Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec le cytochrome c. Enregistrez un flux d’oxygène stable pendant une à deux minutes. Titrer en 3 bolus d’un microlitre de FCCP millimolaire, à l’aide d’une seringue en verre de 10 microlitres.
L’édition FCCP entraîne une brève diminution des niveaux de flux d’oxygène. Attendez que le flux d’oxygène augmente et se stabilise avant d’enregistrer. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec FCCP.
Enregistrez un flux d’oxygène stable pendant une à deux minutes. Une fois le test terminé, tournez doucement et tirez le bouchon vers le haut pour le retirer. Rincez la chambre trois fois avec de l’eau ultra-pure, puis trois fois avec de l’éthanol à 70 %.
Placez les bouchons dans les chambres jusqu’à ce qu’une résistance se fasse sentir, mais ne les fermez pas complètement. Ensuite, bouchez les bouchons. Enregistrez le fichier de test et déconnectez l’instrument du logiciel.
Enfin, éteignez le respiromètre. Dans des échantillons murins correctement préparés, l’ajout de cytochrome c post-ADP n’a pas affecté le flux d’oxygène, confirmant l’intégrité de la membrane mitochondriale externe. Cependant, lorsque les échantillons de tissus n’ont pas été préparés correctement, l’ajout de cytochrome c après l’ADP a entraîné une augmentation de 40 % du flux d’oxygène, indiquant des dommages à la membrane mitochondriale externe.
