Pour commencer, plaquez 3 fois 10 à la puissance 6MCA205 cellules de fibrosarcome dans 10 millilitres de milieu de croissance complet dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Irradiez les cellules avec de la lumière ultraviolette et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins six heures pour les laisser mourir. Lavez in vitro des cellules dendritiques différenciées, ou DC, deux fois, à 1100G pendant quatre minutes dans un milieu de croissance complet.
Comptez les CD vides dérivés de la moelle osseuse à l’aide du test d’exclusion du colorant bleu Trypan. Centrifugez les cellules cancéreuses irradiées à 1100G pendant cinq minutes. Réglez la co-culture de DC vides avec des cellules apoptotiques irradiées dans un rapport de deux pour un dans une plaque à 12 puits pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, lavez les cellules deux fois à 1100G pendant cinq minutes dans 10 millilitres de milieu de croissance complet dans des tubes de 15 millilitres. Pour la coloration de la surface cellulaire, remettre en suspension les CD dérivées de la moelle osseuse dans 20 microlitres de tampon FACS froid et incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après avoir lavé les cellules avec le tampon FACS, ajoutez 100 microlitres de PBS contenant un colorant proche infrarouge fixable pour la vitalité pendant 30 minutes.
Lavez les cellules une fois avec du PBS avant de les remettre en suspension dans le tampon FACS. Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés FSCA et SSCA. Tracez ensuite le FSCA et le FSCH pour exclure les doublets et les amas de cellules de l’analyse.
Tracez une zone de filtre passe-bande d’émission de 780 à 60 nanomètres et SSCA pour éliminer les cellules mortes. À l’aide de filtres passe-bande d’émission de 575 à 26 et de 530 à 30 nanomètres, détectez la positivité cellulaire du marqueur CD11C et du linker de cellules fluorescentes PKH67 dans deux tracés de densité de paramètres. Après le comptage, cultivez les lymphocytes T CD8 avec des CD dérivés de la moelle osseuse qui avaient absorbé les cellules apoptotiques MCA205 dans un rapport de deux à cinq pour un à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures.
Ajouter EdU au milieu de co-culture à une concentration finale de 10 micromolaires et incuber pendant 16 à 20 heures. Centrifugez le CD8 cross prime deux fois à 1100G pendant cinq minutes et colorez les marqueurs de surface dans un tampon FACS froid pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après avoir lavé les cellules deux fois dans le tampon FACS, mettez-les à nouveau en suspension dans 100 microlitres de PBS contenant le colorant aqua fixable à la vitalité pendant 30 minutes.
Lavez une fois les suspensions cellulaires avec trois millilitres de 1% BSA dans PBS dans des tubes d’écoulement. Ajouter 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 minutes pour la fixation cellulaire. Incuber les cellules dans 100 microlitres de réactif de perméabilisation et de lavage à base de saponine pendant 15 minutes.
Ajoutez 500 microlitres du cocktail réactionnel et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après le lavage, remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de réactif de perméabilisation et de lavage à base de saponine. Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés FSEA et SSEA.
Tracez ensuite FSEA et FSEH pour exclure les doublets et les amas de cellules de l’analyse. Tracez une zone de filtre passe-bande d’émission de 525 à 50 nanomètres et un SSCA pour éliminer les cellules mortes. À l’aide de graphiques de densité de filtre passe-bande d’émission de 530 à 30 nanomètres et de 575 à 26 nanomètres, détectez la positivité des cellules pour CD8a et CD3.
Analysez les cellules pour l’incorporation d’Alexa Fluor 647 EdU dans un histogramme à paramètre unique à l’aide d’un filtre d’émission passe-bande de 660 à 620 nanomètres. Les cellules dendritiques positives CD11c ont efficacement englouti les cellules cancéreuses apoptotiques MCA205 à 37 degrés Celsius, démontrant une phagocytose dépendante de la température dans les stades précoces du cycle d’immunité du cancer. Après la phagocytose, les cellules dendritiques ont montré des niveaux accrus de CD86 et de CMH-II ainsi que des niveaux réduits de PDL1.
L’expansion clonale des lymphocytes T CD8 positifs une fois activées par les cellules dendritiques matures était évidente avec un taux de prolifération d’environ 20 %. À l’aide de modèles de tumeurs sur puce, la réponse chimiotactique de ces lymphocytes T envers les alarmines libérées par les cellules cancéreuses a été observée.
