Après avoir récupéré des CD8 amorcés par croisement à partir de coculture, centrifugez-les à 1100 g pendant 10 minutes dans 10 millilitres de milieu de croissance complet. Remettez en suspension 1 x 10 à la puissance 7 cellules totales dans 100 microlitres de microbilles d’élimination des cellules mortes, et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Placez les colonnes de séparation dans le séparateur magnétique et rincez-les avec un tampon de liaison.
Transférez les suspensions cellulaires dans des colonnes de séparation et collectez le flux. Après avoir lavé la colonne, collectez les cellules non étiquetées qui passent à travers et combinez-les avec les cellules précédemment collectées. CD8 vivant enrichi par centrifugation à 1100 g pendant cinq minutes dans un milieu de croissance complet.
Après le comptage, cultivez des cellules CD8 amorcées croiséement avec des cellules MCA205 fraîches dans un rapport de deux pour un dans des plaques à 12 puits, et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Avant de récupérer l’effecteur CD8, ajoutez du monensin et de la brefeldine aux cocultures de cellules immunitaires cancéreuses pendant six heures. Récupérez ensuite l’effecteur CD8 et centrifugez deux fois à 1100 g pendant cinq minutes.
Remettez les cellules en suspension dans trois mélanges d’anticorps primaires différents préparés dans un tampon FACS froid et incubez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Ajoutez 100 microlitres de solution de fixation dans le palais cellulaire à partir du Mix C et incubez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Remettez les cellules en suspension dans un tampon de lavage à froid et incubez pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir lavé les cellules deux fois dans le tampon FACS, ajoutez 100 microlitres de PBS contenant le Vitality Fixable Aqua Dye aux granules de cellules pendant 30 minutes. Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés FSCA et SSCA. Tracez ensuite le FSCA et le FSCH pour exclure les doublets et les amas de cellules de l’analyse.
Tracez le filtre passe-bande d’émission nanométrique 525/50 et le SSCA pour éliminer les cellules mortes, à l’aide de filtres passe-bande d’émission nanométriques 660/20 et 780/60, détectez la positivité cellulaire pour CDAA et CD3 dans deux graphiques de densité de paramètres. De plus, analysez les cellules pour les marqueurs CD44, CD25 et CD69 pour le marqueur CD137, et pour l’interféron gamma positif et le granzyme B pour le mélange A, B et C, respectivement. Pour le test de destruction tumorale, complétez le milieu de coculture avec un colorant de quantification de la mort cellulaire en temps réel.
Après avoir chauffé la plaque à 37 degrés Celsius dans le système d’analyse de cellules vivantes, effectuez un balayage des données toutes les deux heures pendant un maximum de 72 heures. Centrifugez les cellules deux fois à 1000 g pendant cinq minutes. Cellules de coloration pour marqueurs de surface avec 20 microlitres de tampon FACS froid et incubation pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Ajoutez ensuite le colorant vitalité propidium iodure pour colorer les cellules pour une stratégie de gating. Identifiez les cellules d’intérêt en fonction de leurs propriétés FSCA et SSCA. Tracez ensuite le FSCA et le FSCH pour exclure les doublets et les amas de cellules de l’analyse.
Utilisez un filtre passe-bande d’émission de 450/50 nanomètres pour détecter les cellules cancéreuses négatives pour CD45. Dans un histogramme à paramètre unique, à l’aide d’un filtre d’émission passe-bande de 610/620 nanomètres, analysez les cellules pour déterminer si elles contiennent de l’iodure de propidium en tant qu’intensité fluorescente moyenne. Grâce à la cytométrie en flux multiparamétrique, les niveaux d’expression de surface du marqueur d’activation précoce CD69, des marqueurs d’activation tardive CD44 et CD25, de l’expression membranaire de CD137 et de CD107, les marqueurs de réactivité tumorale ont été améliorés.
Les niveaux intracellulaires de molécules cytotoxiques, de granzyme B et d’interféron gamma positifs ont été progressivement et significativement augmentés, atteignant un pic d’expression à 72 heures de coculture. Les cellules MCA205 co-cultivées apparentées ont subi des niveaux significatifs de mort par effecteur CD8.
