Fixation et blocage de cultures de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) 2D pour l’analyse immunohistochimique

Pour commencer, ajoutez 30 millilitres d’hydroxyde de potassium à 5 % dans du méthanol dans un tube de 50 millilitres. Incuber 100 lamelles d’un diamètre de 12 millimètres dans le tube pendant 30 minutes sous agitation constante. Ensuite, lavez les lamelles de couverture dans de l’eau déminéralisée pendant 30 minutes.

Une fois le lavage terminé, transférez les lamelles dans une solution isopropylique à 70 % pour le stockage. Pour enrober les lamelles, appuyez-les d’abord individuellement contre la paroi d’une boîte de Pétri carrée. Lorsque l’alcool isopropylique s’est évaporé, transférez-les dans une plaque à 24 puits.

Pipetez un millilitre de collagène dans du PBS dans chaque puits et incuberez. Ensuite, lavez les lamelles environ 4 à 5 fois pendant cinq minutes chacune avec un millilitre de PBS. Pipeter les HUVECs cultivés dans les puits avec les lamelles de recouvrement enrobées.

Après avoir cultivé les cellules pendant la durée souhaitée, lavez-les dans un millilitre de PBS pendant cinq minutes. Fixez les cellules dans un millilitre de paraformaldéhyde à 2 % pendant 20 minutes à température ambiante. Maintenant, rincez les cellules dans un millilitre de PBS pendant 3 à 4 cycles de lavage de cinq minutes chacun.

Enfin, pipetez un millilitre de tampon de blocage dans la plaque du puits avant de colorer.