Immunocytochimie de sphéroïdes de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) dans une matrice de collagène 3D pour l’étude de l’angiogenèse in vitro

Pour commencer, fixez les gels sphéroïdes germés HUVEC dans un millilitre de paraformaldéhyde à 4% pendant une heure. Lavez doucement les gels dans un millilitre de PBS environ trois à quatre fois. Détachez complètement les gels de la surface de chaque puits de la plaque, puis transférez-les dans de nouvelles plaques à 24 puits.

Ajoutez un millilitre de solution de blocage dans la plaque de puits, puis incubez sur un agitateur orbital pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, pipeter 500 microlitres de la solution d’anticorps primaire dans les puits avant l’incubation. Le lendemain, lavez doucement les gels avec du PBS pendant cinq cycles de lavage de cinq minutes chacun.

Ajouter 500 microlitres de l’anticorps secondaire correspondant dilué avec de la phalloïdine-FITC dans un tampon de blocage. Incuber la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital. Après avoir lavé les gels dans du PBS, transférez-les sur des lames de microscope.

Ajoutez deux gouttes de support de montage contenant du DAPI sur une lamelle et placez-la sur chaque gel. Scellez les gels séchés avec du vernis à ongles. Placez-les dans l’obscurité avant de les stocker à quatre degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie.