Pour commencer, préparez le tampon de lavage en complétant la solution saline équilibrée de Hank avec un tampon de 10 millimolaires. Conservez le tampon à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Préparez l’épithélium pigmentaire rétinien ou le milieu RPE dans du DMEM et préchauffez à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.
Posez la souris euthanasiée à plat sur le côté, l’œil vers le haut. Placez l’index au-dessus de l’œil et le pouce en dessous. Appliquez une légère pression sur la structure osseuse autour de l’œil pour faire saillir le globe oculaire.
Insérez la pointe des ciseaux légèrement ouverts sous l’œil et tournez doucement le poignet en l’éloignant de l’œil de 90 degrés jusqu’à ce que l’œil se détache de l’orbite. Placez immédiatement et roulez l’œil dans de l’éthanol à 70 % pendant cinq secondes. Transférez ensuite l’œil dans un tampon de lavage conservé sur de la glace.
Sous un microscope à dissection, placez l’œil dans une boîte de Pétri remplie de tampon de lavage et de bandes de gaze imbibée. Stabilisez l’œil en tenant le nerf optique à l’aide d’une pince à épiler et à l’aide d’un couteau chirurgical, faites doucement une incision au niveau de l’Ora Serrata. Insérez des ciseaux Vannas dans l’incision et coupez autour de la circonférence de l’Ora Serrata jusqu’à ce que le segment antérieur et le vitré soient retirés.
Décollez doucement la rétine de l’œilleton à l’aide d’une pince attachée sans perturber la couche RPE. À l’aide de ciseaux, retirez le nerf optique et l’excès de tissu conjonctif de l’œilleton sans perforer l’œilleton. Transférez l’œilleton dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de 0,25 % de trypsine et 0,02 % d’EDTA.
Incuber l’œilleton dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Toutes les deux minutes, retirez le tube et tapotez fermement le bas 40 fois sur le plan de travail. Après l’incubation, à l’aide de la pipette AP-1000, mélangez doucement de haut en bas trois fois pour perturber l’œilleton.
Pour neutraliser la trypsine, superposez immédiatement les feuilles d’EPR détachées, à l’exclusion de l’œilleton, sur 0,5 millilitre de FBS dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez du milieu RPE sur les couches de feuilles FBS et RPE pour diluer la trypsine. Centrifugez le RPE à 340G pendant trois minutes.
Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans une quantité appropriée de milieu EPR pour une plaque à 24 puits. Incuber l’EPR à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. 24 heures après l’isolement de l’EPR, les cellules pigmentées d’un nucléé commencent à se stabiliser sans adhérence complète.
Au cours des 48 à 72 heures, ces cellules se fixent et se propagent, conservant une pigmentation foncée dans un noyau transparent. Après cinq jours, les cellules RPE montrent une co-fluidité accrue pour commencer à former des contacts de cellule à cellule en une monocouche polarisée avec des structures hexagonales. L’EPR isolé a montré sa pureté, comme en témoigne le marqueur spécifique de l’EPR et l’intégrité de la jonction serrée après six jours de culture.
