Pour commencer, téléchargez et installez la dernière version de Fidji sur un ordinateur. Après avoir téléchargé le convert_to_TIFF. py script, glissez-déposez le script sur Fiji et exécutez le code.
Accédez au chemin d’accès où l’expérience est stockée. Les fichiers TIFF convertis sont créés dans le même dossier expérimental. Cliquez sur plugins, puis sur 3D Suite, et ouvrez les options du gestionnaire 3D.
Dans la fenêtre du gestionnaire 3D, cochez les cases correspondant au volume en unité, à la valeur de gris moyenne, à la boîte englobante en pixel, à la valeur de gris de l’écart type, au centroïde en pixel et au centroïde en unité. Cochez les cases Exclure les objets sur les arêtes XY et Exclure les objets sur les arêtes Z.Cliquez ensuite sur OK. Ouvrez l’image fluorescente des lymphocytes T humains.
Cliquez sur Ctrl Shift D pour dupliquer le canal protéique, y compris la pile. Cochez la case hyper stack. Spécifiez le numéro de canal approprié dans la zone des canaux et renommez-le en conséquence.
Pour lancer l’enregistreur de macros Fidji, accédez aux plugins, puis aux macros, et sélectionnez enregistrer. Ensuite, pour ouvrir le plugin FindFoci, cliquez séquentiellement sur les plugins GDSC, FindFoci et FindFoci GUI. Dans le menu déroulant de l’image, sélectionnez l’image à analyser.
Réglez le flou gaussien sur 1,5, la méthode d’arrière-plan sur l’écart-type au-dessus de la moyenne, le paramètre d’arrière-plan sur neuf, la méthode de recherche sur la fraction de l’arrière-plan du pic, le paramètre de recherche sur 0,7, la méthode du pic sur le rapport au-dessus de l’arrière-plan, le paramètre de crête sur 0,2 et la taille minimale sur cinq. Définissez les pics max sur des nombres élevés pour inclure tous les foyers dans l’image. Pour améliorer l’identification des foyers, ajustez le flou gaussien en fonction du diamètre des foyers et augmentez les valeurs du paramètre d’arrière-plan pour imposer des seuils plus stricts.
Ensuite, diminuez les valeurs du paramètre de recherche pour inclure les zones plus éloignées du pic de fluorescence et diminuez les valeurs du paramètre de crête pour la séparation des pics. Exécutez FindFoci et copiez la chaîne qui apparaît dans la fenêtre de l’enregistreur. La chaîne contient les paramètres sélectionnés, à l’exclusion des guillemets.
Après avoir téléchargé le script nuclear_prod_q. py, faites-le glisser et déposez-le sur Fidji, puis cliquez sur Exécuter pour exécuter le code. Dans le canal du noyau, entrez le numéro correspondant au canal de DAPI.
Pour le flou gaussien du noyau, entrez la valeur de sigma nécessaire pour flouter l’image pour la segmentation. Ensuite, entrez le numéro correspondant au canal de coloration d’intérêt pour le canal protéique. Dans le paramètre FindFoci, collez la chaîne représentant l’enregistrement de la macro des paramètres sélectionnés.
Cochez la case visuelle et cliquez sur Parcourir pour sélectionner le répertoire dans lequel les images sont stockées. Une fois toutes les cases compilées, cliquez sur OK pour poursuivre l’exécution. Dans la liste des ROI de la fenêtre 3D du gestionnaire de ROI, sélectionnez le canal de noyaux, puis cliquez sur ROI en direct.
Sélectionnez le retour d’intérêt appartenant au même noyau et appuyez sur fusionner. Et pour les noyaux indésirables, appuyez sur supprimer. Encore une fois, cliquez sur ROI en direct pour l’activer, sélectionnez tout et vérifiez que tous les noyaux sont correctement segmentés.
À partir du dossier de quantification, ouvrez le fichier TXT avec les enregistrements des paramètres utilisés pour l’analyse. Ouvrez Google Colab dans un navigateur. Ensuite, à partir du fichier, sélectionnez Ouvrir le carnet et téléchargez les mesures finales des protéines nucléaires.
ipynb. Téléchargez tous les dossiers contenant les fichiers CSV de chaque champ d’image dans le dossier de votre choix dans Google Drive. Dans le notebook, indiquez le chemin d’accès du dossier dans lequel sont stockés les sous-dossiers de résultats et exécutez toutes les cellules.
Une fois la compilation du code terminée, ouvrez le fichier final de la feuille de calcul contenant toutes les données compilées.
