Génotypage le jour même d’embryons murins gastrulants isolés

Après avoir isolé le sac vitellin viscéral de l’embryon de souris, procédez à la digestion de chaque sac vitellin dans un tube de réaction en chaîne par polymérase ou PCR à huit bandelettes. À l’aide d’une pipette P20, ajoutez 19,3 microlitres de tampon de lyse d’ADN de matrice PCR et 0,7 microlitre de 0,2 microgramme par millilitre de protéinase K à chaque échantillon de sac vitellin. Vortex l’échantillon pendant 10 secondes.

Et à l’aide d’une mini-centrifugeuse avec un adaptateur de bandelette, faites tourner les échantillons à 1000 G pendant 10 secondes. Placez le tube PCR à huit bandes dans un bloc de chaleur à 85 degrés Celsius pendant 45 minutes tout en faisant un tourbillon pendant cinq secondes toutes les cinq minutes. Après 45 minutes, faites tourner à nouveau la bande de tube à 1000 G pendant 10 secondes avant de procéder à la PCR pour l’identification génétique souhaitée.

Pour effectuer la réaction PCR pour le génotypage Cre, préparez un mélange maître PCR contenant les composants affichés par tube PCR à huit bandelettes pour chaque sac vitellin. Exécutez le programme d’amplification du cycle thermique PCR en utilisant le cycle affiché. Ensuite, exécutez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 % pour tirer des conclusions de génotypage.

Conservez les échantillons restants de sac vitellin digéré dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Lorsque le produit de PCR a été séparé sur un gel d’agarose, les tailles de fragments attendues pour les allèles LoxP et de type sauvage, ainsi que pour l’allèle Cre ont été observées.