Pour commencer, préparez une solution d’enrobage contenant une matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit et un milieu de culture organoïde dans un rapport de un à deux. Ajoutez 115 microlitres de solution d’enrobage dans chaque puits d’une plaque de 48 puits et placez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié. Pour la méthode du collagène, ajoutez un millilitre de gel de collagène dans un insert de membrane interne de 30 millimètres et laissez-le se solidifier pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié.
Pour récolter le mélange cellulaire, lavez le tissu de mélanome fraîchement réséqué dans une boîte de Pétri de 10 millilitres contenant un produit de lavage qui est placée sur de la glace. À l’aide d’une pince à épiler stérile, transférez la tumeur dans un deuxième plat avec un produit de lavage pour le prochain lavage sur glace. Tout au long des trois cycles de rinçage, à l’aide de ciseaux stériles et d’une lame, retirez l’excès de tissu conjonctif, de graisse et de sang résiduel.
Placez la tumeur dans une boîte de Pétri vide et hachez-la finement avec des lames stériles. Transférez ensuite le tissu haché dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres du milieu de digestion préparé. Placez le cône dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et faites un tourbillon toutes les cinq minutes.
Après 25 minutes, ajoutez 30 millilitres de milieu ADMEM/F12 contenant 10% de FBS pour arrêter la digestion. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire digérée à travers une crépine en nylon de 70 micromètres et rincez la crépine avec de l’ADMEM/F12 supplémenté. À l’aide d’une pipette, récupérez tout média restant au fond du filtre.
Ensuite, granulez les cellules à 300 x g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans le milieu de culture organoïde. Pour la culture, ensemencez 200 000 cellules dans les puits d’avant-guerre enrobés de matrigel, complétés par 200 microlitres de milieu de culture organoïde.
Alternativement, ensemencez 1 million de cellules mélangées à un millilitre de gel de collagène sur l’insert de membrane de gel de collagène pré-solidifié placé dans une plaque à six puits et ajoutez le milieu de culture organoïde dans le puits. Pour le passage d’organoïdes de 150 à 200 micromètres, transférez-les dans un cône de 15 millilitres et lavez-les avec le PBS de Dulbecco. Centrifugez le mélange à 300 x g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir retiré le surnageant, incubez les organoïdes avec le substitut de trypsine et mélangez toutes les trois minutes. Pour arrêter la digestion, ajoutez ADMEM/F12 avec un milieu sérique réduit contenant 10 % de FBS. Centrifuger le mélange à 300 x g pendant sept minutes et remettre le palais en suspension dans le milieu de culture organoïde.
Enfin, ensemencez la suspension unicellulaire dans un nouveau matrigel ou un puits enrobé de collagène à la même densité d’ensemencement initiale pour l’incubation. Les images microscopiques des organoïdes à la fin du matrigel le deuxième et le septième jour ont indiqué que la taille des organoïdes augmentait progressivement. De plus, il n’y avait pas de distinction statistiquement significative dans la proportion de cellules alpha-bêta-T entre les tumeurs parentales et les organoïdes respectifs cultivés dans du matrigel ou du collagène.
