Après avoir élargi les coloïdes dérivés du patient atteint de la maladie de Crohn dans une plaque de 48 puits, retirez doucement le milieu du bord du puits sans endommager le dôme du coloïde. Ajouter 300 microlitres de réactif de dissociation enzymatique complété par 10 ROC1 micromolaires et deux inhibiteurs Y-27632 dans chaque puits. À l’aide d’une pointe de pipette P1000, grattez la surface du puits pour briser le dôme du coloïde et pipetez la suspension cellulaire de haut en bas.
Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Incuber les colonoïdes collectés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifugez les colonoïdes à 400 x g pendant trois minutes et retirez le surnageant, en laissant environ 1,2 millilitre dans le tube.
Ensuite, placez l’extrémité de la pipette P1000 dans la suspension, en la tenant juste au-dessus du bas du tube, puis pipetez rapidement la suspension à l’intérieur et à l’extérieur de l’extrémité pour dissocier les coloïdes. Observez le tube au microscope pour vous assurer qu’il ne reste pas de coloïdes entiers. Et les fragments de coloïdes mesurent environ 30 à 40 micromètres.
Ensuite, ajoutez 10 millilitres de produit de lavage organoïde glacé dans le tube de 15 millilitres. Centrifugez le tube à 400 x g pendant trois minutes. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de produit de lavage organoïde glacé.
Transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et étiquetez-le comme un tube de fragment de colonoïde. Après le mélange, transférez 50 microlitres de l’échantillon dans un nouveau tube et étiquetez-le comme un tube de comptage de cellules. Centrifugez le tube à 400 x g pendant trois minutes.
Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de réactif de dissociation enzymatique, complété par 10 micromolaires d’Y-27632. Incuber le tube de numération cellulaire unique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette P1000 réglée à 400 microlitres, pipetez rapidement l’échantillon.
Observez ensuite l’échantillon au microscope pour assurer une suspension unicellulaire. Ajoutez un millilitre de produit de lavage organoïde dans le tube de comptage de cellules uniques. Ensuite, centrifugez la suspension et retirez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 50 microlitres de média de lavage organoïde.
Ajoutez 50 microlitres de bleu trypan et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Sur cette base, calculez la concentration de cellules dans le tube de fragment de coloïde. Centrifugez le volume requis dans un nouveau microtube de centrifugation de 1,5 millilitre.
Retirez ensuite le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans l’extrait de membrane basale, ou BME. Maintenant, dans une plaque de microtitration préincubée de 96 puits, retournez la pipette de 10 microlitres de la solution de BME colonoïde par puits et mélangez soigneusement la solution régulièrement pour éviter un ensemencement inégal.
Retournez la plaque et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après 20 minutes, recouvrez les dômes de 200 microlitres de milieu de prolifération organoïde préchauffé et poursuivez l’incubation pendant trois jours.
