Après avoir incubé des coloïdes dérivés de patients atteints de la maladie de Crohn pendant trois jours, inclinez la plaque et retirez le milieu du bord des puits. Ajouter 200 microlitres par puits de milieu de traitement des cytokines contenant un colorant fluorescent de mort cellulaire de 2,5 micromolaires. Incuber les colonoïdes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant le temps de traitement requis.
Après l’incubation, transférez la plaque dans la platine d’un microscope à épifluorescence inversée numérique et confirmez que les colonoïdes de la condition de toxicité maximale sont complètement lysés. En utilisant le canal de transmission, concentrez-vous sur un colonoïde avec des cellules SYTOX-positives. Ensuite, passez au canal GFP.
Ajustez l’intensité lumineuse et le temps d’exposition pour maximiser le signal fluorescent tout en minimisant l’arrière-plan. À l’aide de paramètres d’image optimisés, observez les conditions d’absence de colorant et de toxicité maximale pour vous assurer que les échantillons ne sont pas surexposés ou sous-exposés. Acquérir des images de transmission et GFP des colonoïdes à l’aide d’une approche d’échantillonnage aléatoire en sélectionnant des champs de vision qui suivent un motif de grille fixe couvrant le dôme du coloïde.
Enregistrez les images au format graphique du réseau portable et exportez-les. Faites glisser et déposez les fichiers du jeu de données d’image sur la barre d’outils ImageJ et cliquez séquentiellement sur Image, Piles et Images à empiler pour combiner les fichiers. Ensuite, cliquez sur Image puis sur Type et 8 bits pour convertir la pile d’images en un fichier 8 bits.
Cliquez sur l’outil Sélections à main levée et sélectionnez manuellement la région d’intérêt sur l’image de transmission. Ensuite, basculez dans la pile d’images jusqu’à l’image du canal GFP correspondant. Dans la barre d’outils, cliquez sur Analyser et définir les mesures.
Dans la boîte de dialogue Définir les mesures, cochez la valeur Gris moyen et laissez les autres cases décochées. Une fois l’image GFP sélectionnée, cliquez sur Analyser et mesurer. Une fois l’ensemble de données analysé, copiez toutes les données dans la fenêtre des résultats et collez-les dans une feuille de calcul.
Calculez la moyenne des valeurs de gris moyennes de la réplication technique pour chaque condition. Soustrayez la moyenne de l’affection non traitée de chaque affection de traitement. Ensuite, divisez chaque condition de traitement par la moyenne soustraite du bruit de fond de la condition de toxicité maximale.
Pour calculer la viabilité cellulaire après le traitement, soustrayez les valeurs normalisées de un. À l’aide de l’équation donnée, calculez le coefficient d’interaction des perturbagènes. Des images de superposition fluorescente en transmission de coloïdes à huit heures ont indiqué que seuls les colonoïdes traités à l’interféron gamma et au TNF alpha étaient positifs pour le signal fluorescent.
À 24 heures, les colonoïdes traités avec de l’interféron gamma plus TNF alpha présentaient de grandes régions positives pour le signal fluorescent avec une nette dégradation de la morphologie des colonoïdes. Les niveaux de mort cellulaire à huit heures étaient faibles pour les colonoïdes témoins BSA, avec une légère augmentation dans les conditions traitées par TNF alpha. À 24 heures, les colonoïdes traités à l’interféron gamma et au TNF alpha présentaient les taux de mort cellulaire les plus élevés.
Les valeurs de l’IPC indiquaient une légère synergie à huit heures et une synergie substantielle à 24 heures. Cela a confirmé une interaction synergique dépendante du temps entre l’interféron gamma et le TNF alpha.
