Pour commencer, prenez un plat en verre avec un couvercle hermétique. Placez une boule de coton dans le plat. Sous une hotte, ajoutez trois à cinq millilitres d’éther éthylique à la boule de coton.
Couvrez immédiatement le plat avec le couvercle. À l’aide d’un pinceau, prélevez les larves du troisième stade de la drosophile dans des flacons de mouches. Transférez une larve dans un petit récipient ouvert.
Placez le récipient dans le plat en verre avec de l’éther éthylique et fermez immédiatement le plat hermétiquement. Utilisez un microscope de dissection pour vérifier la mobilité de la larve toutes les 30 secondes. Transférez la larve anesthésiée sur une lame de microscope en verre.
Immergez les larves dans une goutte de sérum d’insecte. Sous le microscope de dissection. Retirez la majeure partie de la solution saline à l’aide d’un mouchoir en papier.
Positionnez la face dorsale de la larve vers le haut pour l’ablation des fibres géantes, ou la face ventrale vers le haut pour l’ablation TTMn. Ensuite, abaissez lentement un couvercle en verre sur la larve. Ajoutez une solution saline sur le côté de la lamelle.
Pour remplir l’espace entre la glissière de verre et la lamelle. Pour l’ablation par fibres géantes, vérifiez le positionnement du cerveau sous un fort grossissement sur le microscope de dissection. Assurez-vous que le cerveau est au niveau et qu’il est visible à travers la cuticule.
Pour déplacer tout tissu adipeux recouvrant le cerveau, utilisez des pinces pour appliquer une légère pression sur le couvercle et déplacez le couvercle d’un côté à l’autre. Placez l’échantillon sur une platine de microscope multiphotonique. Utilisez le filtre GFP pour localiser l’échantillon en mode épifluorescence.
Pour l’ablation par fibre géante, concentrez-vous sur les cellules d’intérêt, puis passez en mode deux photons. Réglez le laser sur 870 nanomètres et ajustez le gain du détecteur pour visualiser les cellules exprimant la GFP avec le scanner Galvano, définissez la zone d’ablation à l’aide d’une région circulaire d’intérêt. Ensuite, procédez à la configuration du protocole d’ablation dans le logiciel, pour ce faire, définissez séquentiellement une image d’acquisition, de stimulation, suivie d’une autre image d’acquisition.
Démarrez la puissance du laser de stimulation à une valeur inférieure et exécutez le protocole de stimulation. Si l’ablation n’a pas réussi et que vous ne faites que blanchir la cellule, augmentez la puissance du laser par incréments de 5 % ou le nombre de boucles une à la fois, et exécutez à nouveau le protocole. Faites-le jusqu’à ce qu’une ablation cellulaire réussie soit observée.
Après avoir réussi à ablater la cellule, retirez la lamelle. À l’aide d’un pinceau, ramassez délicatement les larves de la lame, puis transférez-les dans un flacon de nourriture. Dans les échantillons géants d’ablation de fibres.
L’ablation a été vérifiée par l’absence d’un soma marqué à la GFP du côté ablaté du cerveau. Pour les larves ablatées TTMn. L’absence de TTMn d’un côté a été facilement reconnue en raison de l’absence de soma et de dendrites.
