Isolement d’exosomes à partir de cellules cancéreuses épithéliales de l’ovaire de souris pour la génération d’un patch de micro-aiguille

Pour commencer, prenez des cellules cancéreuses épithéliales de l’ovaire de souris en culture. Retirez le milieu de culture des boîtes de Pétri et lavez-les deux fois avec du DPBS. Ajouter 20 millilitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco sans FBS et solution de pénicilline-streptomycine.

Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Ensuite, collectez le surnageant de culture cellulaire à partir de 20 boîtes de Pétri de 15 centimètres de diamètre. Centrifugez à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et récupérez le surnageant.

Centrifugez le surnageant à 2 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et prélevez le surnageant pour éliminer les débris cellulaires. Allumez maintenant la pompe à vide et connectez-la à l’entrée d’air du système de filtration sous vide. Filtrez le surnageant à travers la membrane en polyéthersulfone de 0,22 micron pour éliminer les vésicules ou les impuretés de plus de 0,22 micron.

Ajoutez 15 millilitres de surnageant filtré dans le tube intérieur du tube d’ultrafiltration de 100 kilodaltons. Centrifuger à 3 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le liquide du tube extérieur.

Ensuite, récupérez le liquide de la chambre à air. Ajoutez un millilitre de DPBS dans la chambre à air. Pipetez à plusieurs reprises pour remettre les exosomes en suspension, puis collectez-les.

Centrifuger le liquide à 10 000 G pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un tube à centrifuger à enclenchement rapide de six millilitres et scellez-le avec une thermosoudeuse. Ouvrez le tube après avoir ultracentrifugé le surnageant pendant deux heures.

Une fois le surnageant éliminé, remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de DPBS pour obtenir la solution d’exosome.