Pour commencer, centrifugez le tube contenant des oligonucléotides lyophilisés à pleine vitesse dans une centrifugeuse de paillasse pendant deux à cinq minutes. Remettre les oligonucléotides en suspension dans le tampon TE pour préparer un stock principal de 100 micromolaires et agiter doucement le tube. Diluez une aliquote de matière mère avec un tampon TE pour préparer une pâte de 10 micromolaires et préparez le mélange maître de réaction.
Après avoir distribué le mélange dans les tubes requis, recuire les oligonucléotides dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laissez le tube refroidir à température ambiante pendant 30 minutes à une heure. Ajoutez ensuite des cofacteurs nucléotidiques et d’autres composants tampons sensibles à la chaleur au mélange maître.
Si nécessaire, conservez le mélange à 20 degrés Celsius pour une utilisation future. Combinez 22,5 microlitres du mélange maître de substrat avec 2,5 microlitres d’ADN ligase dans un tube PCR. Placez immédiatement les tubes de réaction dans une machine PCR à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Pour éteindre la réaction, ajoutez cinq microlitres de colorant de chargement et incubez à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.
