Détection de microdomaines Ca²⁺ à un niveau subcellulaire dans les lymphocytes T murins primaires à l’aide de la microscopie à fluorescence

Pour commencer, placez 10 microlitres de cellules CD4+ chargées sur la lame préparée et laissez-les fixer pendant trois à cinq minutes. Ajoutez délicatement 80 microlitres de tampon de mesure du calcium sur la lame. Sélectionnez l’objectif à immersion dans l’huile 100X.

Appliquez une petite goutte d’huile d’immersion et placez la lame sur la platine du microscope. Ajustez ensuite la mise au point en mode fond clair. Sélectionnez un champ de vision avec jusqu’à 10 cellules qui ne sont pas en contact les unes avec les autres et acquérez une image.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de billes enrobées d’anticorps ou de stimulant après une minute, et mesurez pendant un total de trois minutes en utilisant 40 images par seconde ou la fréquence d’images maximale possible. Utilisez le curseur pour localiser le temps de contact entre une bille et une cellule d’intérêt. Dans le menu Options sur le côté droit, sélectionnez contact de perle : x, y, t.

Sélectionnez l’endroit sur le côté gauche de l’image où la cellule et la perle entrent en contact. Sélectionnez Choisir une cellule en cliquant sur un point à l’intérieur. Cliquez sur la cellule stimulée par cette perle, de préférence au centre.

Cliquez sur AJOUTER le contact de la perle. Une fois que tous les contacts de perles sont définis, cliquez sur le bouton Continuer et passez aux fichiers supplémentaires. Les cellules de type sauvage ont montré une formation rapide de microdomaines de calcium dans la première seconde après la stimulation, qui s’est étendue dans toute la cellule au cours des 15 secondes suivantes. À l’inverse, les cellules mutantes P2x4 et P2x7 ont montré une diminution de la formation de microdomaines calciques, les cellules mutantes P2x4 présentant également un niveau basal plus bas avant la stimulation.

Comme pour les lymphocytes T murins, des microdomaines calciques ont été observés au site de contact des billes dans les lymphocytes T CD4+ humains.