Pour commencer, placez la culture cellulaire Sf1Ep trypsinisée et une plaque à 6 puits sur une plate-forme de travail. Ajoutez le nombre approprié de cellules Sf1Ep et de milieu Sf1Ep dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit.
Combinez les composants de TpCM-2 dans un récipient stérile, en ajoutant du dithiothréitol sous forme de poudre sèche en dernier. Mélangez délicatement et filtrez pour stériliser le milieu à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 micromètre. Pré-équilibrez le milieu dans un bocal anaérobie, évacuez la chambre à l’aide du vide domestique et remplissez-la trois fois avec un mélange de 95 % d’azote et 5 % de dioxyde de carbone.
Ensuite, remplissez avec 1,5% d’oxygène, 5% de dioxyde de carbone et équilibrez le mélange d’azote gazeux. Transférez rapidement le milieu dans un incubateur trigaz, installez-le à 34 degrés Celsius et incubez pendant la nuit. Après une nuit d’incubation, retirer le milieu de la culture Sf1Ep et rincer les cellules avec un petit volume de TpCM-2 pré-équilibré.
Après avoir retiré le rinçage, ajoutez une quantité appropriée de TpCM-2 et équilibrez la plaque avec 1,5 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone et équilibrez l’atmosphère azotée à 34 degrés Celsius pendant trois à quatre heures. Retirez la culture existante de T. pallidum de l’incubateur à faible teneur en oxygène et examinez la couche de cellules Sf1Ep dans chaque puits. Après avoir enregistré la densité et l’apparence des cellules, pipetez le milieu de chaque puits dans un tube conique stérile de 15 millilitres.
Rincez bien chaque pièce avec 0,35 millilitre de trypsine-EDTA préchauffée et ajoutez le rinçage dans le tube de 15 millilitres. Ajoutez encore 0,35 millilitre de trypsine-EDTA dans chaque puits et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour retirer les cellules Sf1Ep de la plaque et T. pallidum de la cellule Sf1Ep. Après détachement, combiner les cellules dissociées de T. pallidum et Sf1Ep avec le milieu de réserve recueilli dans le tube conique de 15 millilitres et enregistrer le volume total récupéré pour le calcul du rendement par culture.
Inoculer la plaque de cellules Sf1Ep préalablement préparée avec un volume défini de T. pallidum récolté. Après avoir échangé l’atmosphère dans la plaque, incuber à 34 degrés Celsius dans le bocal de l’infuseur ou dans un incubateur trigazeux. Après l’inoculation, utiliser une chambre de comptage auxiliaire pour dénombrer T. pallidum au microscope à fond noir.
Ajouter 50 % de glycérol à une concentration finale de 10 % à la culture de T. pallidum et disperser le glycérol par pipetage doux ou inversion. Répartissez la préparation dans des aliquotes d’un à deux millilitres dans des flacons de congélation à bouchon vissé, et placez immédiatement les flacons dans un congélateur à 80 degrés Celsius ou un congélateur à azote liquide. Préparez et pré-équilibrez deux plaques de 96 puits avec 1000 cellules Sf1Ep et 200 microlitres de TpCM-2 par puits et incubez pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire.
Le lendemain, remplacez le support Sf1Ep par le TpCM-2 comme décrit précédemment. Après la quantification, diluer T. pallidum dans TpCM-2 pour produire deux préparations avec des concentrations de 10 et 40 cellules par millilitre. Inocuculer 50 microlitres par puits de la préparation de 10 T. pallidum par millilitre dans l’une des plaques préparées de 96 ans.
Dans les deux puits de contrôle de chaque plaque, inoculez le 2 x 10 à la puissance trois T. pallidum par millilitre de dilution. Équilibrez les plaques avec le mélange gazeux à faible teneur en oxygène et incubez-les dans un bocal ou un incubateur trigaz à 34 degrés Celsius. Le septième jour, retirez la moitié du milieu et remplacez-le par du TpCM-2 frais et équilibré.
Une fois que les puits positifs sont identifiés par la microscopie à fond noir, essayez de les tester et transférez la suspension cellulaire sur les plaques à 24 puits préalablement préparées pour une expansion supplémentaire. T. pallidum conserve généralement plus de 90 % de motilité et se multiplie logarithmiquement avec un temps de doublement de 33 à 45 heures pendant environ sept jours avant d’entrer dans la phase stationnaire. Au cours d’une semaine, les spirochètes ont subi environ quatre à cinq doublages.
