Pour commencer, placez les trophozoïtes de Naegleria gruberi congelés à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Cultivez les trophozoïtes dans un milieu PYNFH à 25 degrés Celsius jusqu’à environ 80 % de confluent. Placez le ballon confluent sur de la glace pendant cinq à 10 minutes pour libérer les trophozoïtes collés du plastique.
Ensuite, agitez doucement le ballon pour déloger les cellules adhérentes restantes. Remplacez le milieu par un milieu d’enkystement stérile pour enkyster les cellules de Naegleria gruberi. Après 48 heures, retirez les kystes de la fiole.
Centrifugez les kystes à 600 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, remettre les kystes en suspension dans deux millilitres de milieu PYNFH avec 10% de sérum de veau fœtal pour exkyster les cellules. Incuber les kystes à 25 degrés Celsius pendant 72 heures jusqu’à ce que les trophozoïtes émergent et atteignent 80 % de confluence.
Pour transfecter les trophozoïtes, placez d’abord un millilitre de trophozoïtes dans une plaque de culture tissulaire à six puits à fond plat. Ensuite, incubez le mélange de réactifs de transfection plasmidique à température ambiante pendant 10 minutes. Pipeter environ 800 microlitres de milieu à partir des monocouches de trophozoïtes juste avant la transfection.
Ajoutez ensuite 200 microlitres du mélange de réactifs de transfection plasmidique aux trophozoites. Tournez doucement la plaque toutes les 15 minutes pour éviter que le média ne s’agrège sur les bords de la plaque et ne se dessèche. Au bout d’une heure, ajoutez 10 unités de DNase dans un millilitre de tampon DNase 10X et ajoutez-le dans les puits.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour éliminer l’ADN plasmidique résiduel. Lavez maintenant l’assiette une fois avec un millilitre de milieu de croissance, puis ajoutez deux millilitres de milieu frais. Incuber la plaque à 25 degrés Celsius pendant 24 à 36 heures.
Lorsque l’incubation est terminée, divisez le contenu d’un puits dans une nouvelle plaque dans un rapport de 1:2. Ensuite, collectez les trophozoïtes des puits restants pour une analyse plus approfondie. Les trophozoïtes de Naegleria gruberi étaient amiboïdes et adhéraient aux flacons de culture dans des conditions de culture standard.
Leur incubation sur glace a donné lieu à des trophozoïtes ronds et non adhérents. L’incubation des trophozoïtes dans les milieux enkystiques les a amenés à s’enkystecher.
