Pour commencer, ajoutez 200 microlitres de chlorure de sodium de 100 millimolaires dans un tube contenant des trophozoïtes transfectés de naegleria gruberi. Centrifugez le tube à 600G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres d’EDTA de 100 millimolaires.
Placez le tube dans un bloc de chaleur pendant 15 minutes à 98 degrés Celsius pour lyser les cellules. Centrifugez le tube à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes à vitesse maximale pour granuler les débris. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.
Ensuite, ajoutez 0,5 volume d’acétate d’ammonium, trois volumes d’éthanol absolu et un microlitre de glycogène au surnageant. Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger, avant de l’incuber à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes ou toute la nuit. Après l’incubation, centrifugez les tubes à température ambiante pendant 10 minutes à 16 000 G.
Retirez le surnageant sans déranger la pastille, et ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 70% pour la laver avant la centrifugation. Remettre en suspension la pastille séchée dans de l’eau déminéralisée stérile pour obtenir une densité de trophozoïtes de 10 000 trophozoïtes par microlitre. Après PCR avec amorce spécifique pour l’ADN transfecté et détection des trophozoïtes transformés, ajoutez deux microlitres de colorant de chargement 6X aux échantillons CERE.
Ensuite, chargez les échantillons teints sur un gel d’agarose à 0,8 %. Après avoir électrofluorescence le gel pendant 1,5 à 2 heures, incubez-le dans un colorant d’ADN dilué dans 100 millilitres d’eau déminéralisée. Transférez le gel coloré dans de l’eau déminéralisée pendant 20 minutes pour le décolorer.
Visualisez le gel sur un système de lumière ultraviolette pour documenter les résultats. L’analyse PCR a montré que pGRUB a été détecté dans les trophozoïtes transfectés par au moins sept passages. Le pGEM a été perdu après le premier passage, ce qui indique que le plasmide vide n’a pas été retenu par les amibes.
