Pour commencer, cultivez les CSM dans une plaque à six puits avec le milieu CSM humain contenant 1% de pénicilline et de streptomycine. Procédez ensuite au marquage des cellules MITO-RFP ARPE19 avec des traces cellulaires violettes dans la membrane cytoplasmique. Pour ce faire, ajoutez 20 microlitres de diméthylsulfoxyde dans un flacon de réactif de trace de violet cellulaire et mélangez bien immédiatement avant l’utilisation.
Augmentez la densité souhaitée de 80 à 90 % pour atteindre la densité souhaitée. Pour préparer la solution de chargement, diluez la solution mère de traces de cellules violettes dans du DPBS préchauffé. Retirez ensuite le milieu de culture des cellules et remplacez-le par un millilitre de solution de chargement. Incuber les cellules pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, retirez la solution de chargement. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du DPBS, ajoutez deux millilitres de milieu frais et complet. Ensuite, incubez les cellules pendant au moins 10 minutes à 37 degrés Celsius pour permettre à la trace violette cellulaire de subir une hydrolyse de l’acétate.
Ensuite, préparez une plaque de 24 puits en ajoutant 50 microlitres de DPBS dans chaque puits. Insérez le verre de protection dans la plaque et laissez-le reposer pendant une minute. Retirez le DPBS des puits en utilisant une pression négative pour vous assurer que la glissière du couvercle est proche du fond du plat.
Une fois que la densité cellulaire atteint 80 à 90%, retirez le milieu d’origine et lavez les cellules une fois avec du DPBS, ajoutez un millilitre du mélange trypsine EDTA DPBS et incubez pendant trois à quatre minutes à 37 degrés Celsius. Tapotez ensuite doucement la plaque à six puits pour détacher les cellules collées. Ajouter un millilitre de milieu frais et complet pour terminer la digestion.
Ensuite, remettez doucement en suspension toutes les cellules à l’aide d’un pistolet à pipette et transférez toutes les cellules collectées dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Maintenant, centrifugez les cellules à 200 G pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu frais.
Placez 10 microlitres de suspension cellulaire sur une plaque de comptage pour le dénombrement. Après avoir ensemencé les cellules MSC et ARPE19 dans la plaque de 24 puits, observez les cellules au microscope. Secouez la plaque jusqu’à ce que les cellules soient uniformément réparties.
Incuberez-les dans la culture pendant 24 heures. Pour la co-culture indirecte, voir 10 000 cellules ARPE19 dans 500 microlitres de milieu par puits d’une plaque de 24 puits. Placez l’insert dans le puits où les cellules ont été ensemencées.
Ensemencez 10 000 cellules souches mésenchymateuses dans 100 microlitres de milieu dans la chambre cellulaire supérieure par puits.
