Pour commencer, retournez doucement des tubes de sang entier de 10 millilitres 10 fois à température ambiante. À l’aide d’un rotor à godets oscillants, centrifugez les tubes à 800 g pendant 10 minutes à 22 degrés Celsius avec le frein serré. Placez ensuite les échantillons dans une enceinte de sécurité biologique et vérifiez la présence des trois couches distinctes.
Étiquetez trois tubes de polystyrène de cinq millilitres avec les lettres A, B et C.Tourbillonnez et prélevez un millilitre de couche leucalaire par aspiration et transférez-le dans le tube étiqueté A.Ajoutez ensuite 60 microlitres d’EDTA 0,1 molaire au tube A contenant la couche leucocytaire. Ajoutez 50 microlitres du mélange à cocktail dans le tube A.Pipette de haut en bas au moins trois fois pour le mélanger et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après cela, ajoutez 890 microlitres de PBS dans le tube A et mélangez par pipetage au moins trois fois.
Ensuite, faites tourbillonner le tube à billes magnétiques pendant 30 secondes. Ajoutez 50 microlitres de billes magnétiques dans le tube A et pipetez au moins trois fois pour bien mélanger les billes. Placez immédiatement le tube A dans le support magnétique et incubez pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, pipetez soigneusement la suspension de cellules enrichies dans le tube B, en recueillant la fraction claire avec peu ou pas de globules rouges pour une récupération optimale de la PBMC. Après cela, retirez le tube A du support d’aimant et jetez-le. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes magnétiques à la suspension cellulaire dans le tube B et pipetez de haut en bas au moins trois fois.
Placez immédiatement le tube B dans le support magnétique et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Pipetez soigneusement la suspension cellulaire enrichie dans le tube C, en ne recueillant que la fraction claire. Retirez le tube B du support magnétique et jetez-le.
Ensuite, placez immédiatement le tube C dans le support magnétique et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Pipetez soigneusement la suspension cellulaire enrichie dans un tube à centrifuger étiqueté et complétez jusqu’à deux millilitres avec du PBS. Transférez 50 microlitres de suspension de cellule dans un gobelet d’échantillon du compteur de cellules automatisé.
Ajouter 450 microlitres de PBS pour une numération cellulaire de dilution de 1 à 10.
