Pour commencer, placez la souris anesthésiée sur un appareil stéréotaxique. Faites une incision continue le long de la ligne médiane du cuir chevelu à l’aide de ciseaux chirurgicaux et coupez une partie du cuir chevelu pour exposer la surface du crâne. Faites la craniotomie dans la région spécifiée avec la micro-perceuse et définissez quatre points comme bordure.
Arrêtez de forer lorsque le tissu cérébral devient visible. Utilisez le panneau de commande pour régler l’injecteur afin d’injecter 80 nanolitres du virus. Cliquez sur le bouton Injecter sur le panneau de configuration pour injecter le virus dans le gyrus denté à un débit de 1 nanolitre par seconde.
Pour aspirer le tissu cérébral, tournez la pointe de l’aiguille émoussée près du tissu cérébral et appuyez doucement pour faciliter l’aspiration. Rincer continuellement avec une solution saline froide pendant l’aspiration pour maintenir une vue dégagée du cerveau. Observez de près les caractéristiques des tissus pour surveiller la profondeur de l’aspiration.
Le tissu cortical est rose pâle. Le corps calleux en dessous se présente sous la forme d’un tissu fibreux blanc. Et la couche CA1 de l’hippocampe est rouge foncé et grise.
Arrêtez l’aspiration lorsque la surface du tissu devient lisse et qu’une grande surface de CA1 est exposée. Déplacez le support fixé à la lentille grin au-dessus du trou percé. Lorsque la lentille grin entre en contact avec la surface du tissu cérébral, réglez l’axe Z à zéro.
Insérez la lentille grin dans le trou au niveau de l’axe ventral dorsal moins 1,32 millimètre. Laissez le support reposer pendant 5 à 10 minutes. Ensuite, soulevez le support et rincez le trou avec une solution saline.
À l’aide d’une aiguille, appliquez la résine ultraviolette autour de la lentille Grin. Éclairez la zone avec une lumière ultraviolette pendant 15 secondes pour vous assurer que la résine devient solide. Retirez délicatement le support de l’objectif grin.
Couvrez tout le crâne exposé avec de la résine ultraviolette. Placez la plaque de tête sur le crâne dans la position appropriée. Illuminez l’ensemble du crâne et de la plaque frontale avec une lumière ultraviolette pendant 15 secondes.
Couvrez la lentille grin exposée avec un capuchon de protection imprimé en 3D. Fixez le capuchon à la plaque de tête à l’aide de vis M1.6. Allumez le logiciel de contrôle Miniscope et cliquez sur Sélectionner le fichier de configuration.
Ensuite, sélectionnez vscode, puis Fichiers de configuration utilisateur. Maintenant, cliquez sur Exécuter. Ensuite, faites glisser le bouton d’alimentation LED pour régler la luminosité.
Faites glisser le bouton de réglage de la mise au point pour régler la valeur près de zéro. Fixez la plaque de base au mini-télescope et réajustez la position du mini-télescope pour obtenir un champ de vision avec une bonne qualité d’image. Appliquez soigneusement la première couche de matériau de base de la prothèse autour de la plaque de base du mini scope.
Une fois que la première couche de ciment a durci, appliquez une deuxième couche de ciment de la plaque de base sur la plaque de tête. Une fois que tout le matériau de base de la prothèse a durci, desserrez la vis de réglage et détachez le mini-scope de la plaque de base. Insérez le capuchon de la plaque de base dans la plaque de base pour protéger la lentille grin exposée et serrez la vis de réglage.
Après l’imagerie, convertissez les données d’imagerie du format AVI au format HDF5. Appliquez la correction de mouvement non rigide et sous-échantillonnez le film corrigé de mouvement. Appliquez l’extrait sur les données de sous-échantillonnage pour identifier les signaux de cellule unique.
Ensuite, appliquez la vérification des cellules et sélectionnez manuellement les cellules potentielles. Cliquez sur Enregistrer les données avant de fermer la fenêtre de vérification des cellules. Enfin, enregistrez les fichiers de données.
Lors de l’imagerie calcique in vivo infructueuse, aucune cellule active n’a été observée dans le champ de vision de l’imagerie. L’imagerie calcique in vivo réussie a montré moins de 10 cellules actives sans vaisseaux sanguins évidents. Plus de 50 cellules actives avec des vaisseaux sanguins visibles.
Et des centaines de cellules actives avec des vaisseaux sanguins clairs. Les cellules individuelles extraites d’un enregistrement réussi d’imagerie calcique in vivo ont été superposées dans le champ de vision avec des traces de calcium représentatives. La position de l’expression de GCaMP6F et la trace de la lentille du sourire ont été vérifiées dans la tranche de cerveau de souris.
