Pour commencer, obtenez l’échantillon de tissu tumoral digéré et les poux des globules rouges. Centrifugez l’échantillon à 450 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le média, remettez la pastille en suspension dans un millilitre du média d’isolement.
Après avoir répété la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de milieu d’isolement. Transférez 100 microlitres d’échantillon dans un puits d’un tube de bandelette PCR de 0,2 millilitre. Dans une hotte de biosécurité, ajoutez 10 microlitres chacun de cocktail annexine V et de cocktail de sélection de biotine à l’échantillon.
Mélangez la solution à l’aide d’une pipette et laissez incuber à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, faites tourbillonner les particules magnétiques enrobées de dextran pendant 30 secondes. Mélangez 20 microlitres de billes et 60 microlitres de milieu d’isolement avec l’échantillon.
Après trois minutes, placez le tube de bandelette sur un séparateur magnétique 10x Genomics sur le réglage élevé pendant cinq minutes à température ambiante. Transférez ensuite le liquide du tube à bande sans déranger les billes dans un nouveau tube à centrifuger à faible liaison de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube comme démontré précédemment, et remettez le granulé en suspension dans un volume approprié de notre média PMI en fonction de la taille du granulé.
Enfin, comptez les cellules dans un hémocytomètre. Après l’élimination des cellules mortes, le nombre de cellules vivantes était de 4,9 fois 10 à la puissance 5 par millilitre, avec une viabilité supérieure à 90 %
