Pour commencer, procurez-vous une plaque de culture avec les colonies de l’espèce LW13 de Methylomonas. Inoculer les colonies dans six millilitres de sels minéraux nitrés dans un tube de verre. Scellez le tube avec un bouchon de sérum et un joint de sertissage en aluminium.
Ajoutez du méthane à l’aide d’une seringue pour créer une atmosphère finale de 50 % de méthane en volume dans l’air. Agitez cette culture liquide planctonique à 200 tours par minute à température ambiante jusqu’à ce qu’elle soit trouble, ce qui prend environ une journée. Passez les cultures liquides dans un rapport de un à 10 dans un milieu frais.
Continuer à cultiver les cultures liquides de méthanotrophes pour loger la croissance de phase, atteignant une densité optique à 600 nanomètres d’environ 0,5. Pour préparer la seringue, retirez les pistons qui l’accompagnent et placez-la dans un récipient stérile. Fixez une pointe filtrante stérile en polytétrafluoroéthylène ou en PTFE à chaque seringue et placez la seringue dans un support de tube à essai standard avec l’embout vers le bas.
Ensuite, mélangez un millilitre de cellules avec cinq millilitres de sels minéraux nitrés et quatre millilitres d’agarose fondu dans un tube conique stérile. Versez lentement le mélange d’agarose dans la seringue jusqu’à la marque de huit millilitres et laissez-le se solidifier. Après environ 15 minutes, fermez la seringue avec un bouchon en caoutchouc butyle stérile de 20 millimètres.
Fixez les bouchons avec du ruban adhésif et étiquetez la seringue. Ensuite, remplissez une grande seringue de 60 millilitres avec du méthane à 100 % et fixez un embout filtrant en PTFE connecté à une aiguille stérile de calibre 23. Percez le bouchon en caoutchouc de la seringue avec le mélange d’agarose à l’aide d’une grande seringue et insérez une deuxième aiguille stérile comme sortie de gaz.
Appuyez sur le piston de la grande seringue pour permettre à 20 millilitres de méthane à 100 % de s’écouler dans l’espace de tête. Retirez l’aiguille de sortie lorsqu’il reste un à deux millilitres de méthane dans la seringue pour éviter le reflux d’oxygène. Incuber la seringue avec un mélange d’agarose et de méthane à 18 degrés Celsius.
Pour extruder l’agarose, remplacez l’embout du filtre en PTFE par une aiguille stérile de calibre 23 et le bouchon en caoutchouc par le piston de seringue fourni. Appuyez lentement sur le piston pour distribuer des incréments d’un millilitre dans des tubes à microcentrifuger stériles séparés de 1,5 millilitre. La souche sauvage LW13 a formé une bande horizontale distincte à une profondeur spécifique dans la seringue à gradient où les concentrations de méthane et d’oxygène étaient faibles.
LW13 inoculé dans des seringues à gradient a montré un contre-gradient méthane-oxygène avec une appauvrissement en méthane et une consommation d’oxygène correspondant à la profondeur de la bande horizontale. Le mutant de délétion OAT de LW13 n’avait pas la formation distincte de la bande horizontale observée dans la souche de type sauvage, ce qui indique le rôle du gène dans ce phénotype.
