Pour commencer, obtenez les segments d’agarose extrudés à partir de seringues à gradient, inoculées avec des espèces de méthylomona de type sauvage ou mutantes, LW13. Ajouter 0,75 millilitre de chlorure de sodium à 0,85 % dans l’eau à l’échantillon d’agarose extrudé et homogénéiser par vortex. De plus, diluez l’échantillon de 1 à 10 dans un nouveau microtube à centrifuger avec 900 microlitres de solution saline.
Incuber les échantillons avec trois microlitres d’un mélange individuel de colorants SYTO 9 et d’iodure de propidium dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes. Pour déterminer les cellules par millilitre d’agarose, sonicez la suspension de billes de comptage des microsphères dans un bain-marie pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 10 microlitres de suspension à l’échantillon avant l’analyse par cytométrie en flux.
Analysez des échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux. Comparez les diagrammes d’opération de diffusion latérale et de diffusion vers l’avant entre les échantillons de contrôle acellulaire et les échantillons d’agarose inoculés pour dessiner des portes de tension d’événement bactérien qui excluent les particules d’agarose de fond. Pour compter les unités formant colonies dans la seringue à gradient, ajoutez 800 microlitres de sels minéraux nitrés au segment d’agarose extrudé et au vortex pendant 10 secondes pour faciliter le pipetage.
Préparez une plaque stérile de 96 puits avec 180 microlitres de sels minéraux nitrés dans chaque puits. Ajouter 20 microlitres d’échantillon d’agarose dilué dans chaque puits de la première colonne et mélanger. À l’aide d’une pipette multicanaux, diluez en série 20 microlitres d’échantillons par dix, en commençant par la première rangée de puits.
Étiquetez la plaque à grille carrée contenant des sels minéraux nitrés, la tarière ou le milieu de votre choix. À l’aide d’une pipette multicanaux, repérez cinq microlitres d’une colonne de la plaque à 96 puits sur la plaque de la vis sans fin. La cytométrie en flux utilisant les échantillons d’agarose extrudé a confirmé que le mutant de délétion OAT de LW13 présentait une croissance cellulaire réduite par rapport à la souche de type sauvage.
La complémentation du mutant avec le gène OAT a rétabli le nombre de cellules et la formation de bandes à des niveaux similaires à ceux du type sauvage, indiquant le rôle spécifique du gène dans la formation de bandes.
