Pour commencer, dans une hotte de culture cellulaire, ajoutez le lipoaspiration récolté dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Transférez le lipoaspiration dans une seringue Luer lock stérile de 20 millilitres. Fixez ensuite un connecteur de 1,4 millimètre à la seringue.
Fixez maintenant une deuxième seringue Luer lock de 20 millilitres sur le côté controlatéral du connecteur. Poussez le tissu adipeux d’une seringue à l’autre environ 30 fois. Transférez ensuite la graisse émulsionnée dans un tube à centrifuger frais de 50 millilitres.
Centrifuger la graisse à 500 G pendant 10 minutes. Jetez ensuite la couche supérieure huileuse. Récupérez la couche centrale purifiée contenant la couche vasculaire stromale séparée et transférez-la dans un tube à centrifuger frais de 50 millilitres.
Remplissez maintenant le tube de centrifugation avec du DMEM supplémenté jusqu’à 40 millilitres. Centrifugez à nouveau le tube à 500 G pendant cinq minutes. Récupérez la couche mSVF résultante et transférez-la dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres.
Dans un tube stérile de 1,5 millilitre, pipetez 100 microlitres de la fraction vasculaire stromale isolée. À cela, ajoutez 10 microlitres de thrombine, puis pipetez 10 microlitres de chlorure de calcium. Enfin, ajoutez 70 microlitres d’acide tranexamique au mélange.
Avec une pointe de pipette neuve, ajoutez 10 microlitres de fibrinogène dans le tube peu de temps avant l’application. Après la polymérisation du mélange d’hydrogel mSVF, pipetez 200 microlitres de l’hydrogel dans une plaque à 12 puits à des fins d’analyse. Ajoutez maintenant 100 microlitres de fibrine hydrogel dans un puits comme témoin négatif.
Incuber la plaque à 12 puits à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de culture préchauffé dans chaque puits. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur pendant quatre heures.
Ajoutez un millilitre de résine dans chaque puits avant de l’incuber à nouveau pendant 24 heures. Pipeter les échantillons de résazurine dans une plaque de 96 puits. Le lendemain, utilisez un lecteur de microplaques multimode d’imagerie cellulaire pour mesurer la première intensité de fluorescence.
Pour l’analyse histologique les jours un, trois et sept, incubez l’hydrogel de fibrine dans 0,5 millilitre de paraformaldéhyde à 4 %. Ajoutez maintenant 1 % de PBS dans l’assiette et conservez-la à quatre degrés Celsius. Le dosage de la résazurine a été réalisé pour quantifier les viabilités cellulaires in vitro de la fraction vasculaire et de l’hydrogel.
La fraction vasculaire a montré une viabilité réduite au troisième jour, tandis que l’association mSVF-fibrine hydrogel est restée proche de la valeur initiale. Au septième jour, la viabilité de la mSVF a chuté, tandis que la combinaison mSVF-fibrine hydrogel a augmenté. L’analyse histologique n’a montré aucune réduction du nombre de noyaux cellulaires aux troisième et septième jours.
L’hydrogel de fibrine a montré une dégradation minimale avec des amas de cellules visibles uniformément répartis.
