Pour commencer, obtenez de la microglie humaine à partir des cellules souches embryonnaires humaines et récoltez-les au 56e jour. Pour la dérivation d’organoïdes rétiniens, cultivez les cellules souches embryonnaires humaines dans un milieu de cellules souches jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 80 à 90 %Ajoutez un millilitre de dispase par puits aux cellules de culture et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir retiré la dispase, ajoutez un millilitre de milieu D dans chaque puits.
Coupez les cellules en petits morceaux. À l’aide d’une pipette de 10 microlitres, collectez délicatement tous les morceaux de cellules et le milieu dans un tube à microcentrifuger de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 200 x g pendant cinq minutes.
Après avoir retiré le surnageant, remettez doucement les cellules en suspension dans 200 microlitres d’une matrice froide. Placez le tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre dans un incubateur pendant 20 minutes. Après 20 minutes dans l’incubateur, la matrice se solidifiera.
Préparez un plat de 10 centimètres avec 15 millilitres de D moyen.Remettez en suspension la matrice avec le D moyen et secouez doucement la boîte de Pétri. Placez le plat dans un incubateur pendant cinq jours. Le 12e jour, remplacez le milieu par trois millilitres de dispase.
Après cinq minutes, aspirez la dispase et ajoutez 15 millilitres de milieu E.Introduisez la microglie récoltée dans les organoïdes rétiniens digérés le jour 12. Le jour 19, faites tourner doucement l’assiette pour agréger les organoïdes au centre du plat et remplacez le milieu E par le moyen F.Enfin, transférez les organoïdes avec le moyen F dans un nouveau plat de suspension. Au 30e jour, les organoïdes rétiniens co-cultivés avec la microglie ont montré une autofluorescence GFP significative, indiquant la présence de la microglie.
Les organoïdes rétiniens co-cultivés ont montré des signaux d’immunofluorescence clairs pour le marqueur photorécepteur CRX et le marqueur microglial IBA1.
