Procédez à l’exécution de la réaction après avoir fonctionnalisé les deux extrémités du substrat d’ADN linéaire. Tout d’abord, prenez quatre colonnes de rotation S-400 et faites-les tourbillonner pendant au moins 30 secondes pour remettre la résine en suspension. Ensuite, centrifugez-les pendant une minute à 735G pour retirer la mémoire tampon de stockage.
Transférez les colonnes pour nettoyer les tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de la solution d’ADN linéaire doublement fonctionnalisée dans chaque colonne. Centrifugez les colonnes pendant deux minutes à 735G pour faire circuler l’ADN à travers la colonne tout en conservant les nucléotides non incorporés.
Après avoir regroupé le flux contenant l’ADN des quatre colonnes, mesurez le volume à l’aide d’une pipette. Ensuite, utilisez des billes magnétiques enrobées de streptavidine pendant 30 secondes pour les remettre en suspension. Transférez quatre milligrammes de billes magnétiques remises en suspension dans un tube propre de 1,5 millilitre.
Placez le tube dans un support magnétique pendant une minute pour recueillir les billes avant de retirer la mémoire tampon de stockage. Remettez les billes en suspension dans un millilitre de tampon A en agitant pendant cinq secondes avant d’incuber les billes à température ambiante pendant cinq minutes. Récupérez les perles en plaçant le tube dans un support magnétique pendant une minute.
Après avoir retiré le tampon A, remettre les billes en suspension dans 400 microlitres de tampon 2X A par pipetage. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de la solution d’ADN fonctionnalisée aux billes et mélangez doucement par pipetage. Incuber le mélange d’ADN de billes pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec rotation de bout en bout.
Le lendemain, utilisez le support magnétique pour retirer le surnageant avant de calculer la quantité totale d’ADN liée aux billes magnétiques. Ensuite, lavez les billes séquentiellement avec le tampon B et le tampon C.Remettez les billes en suspension dans 300 microlitres de tampon C et faites quatre aliquotes de 75 microlitres.
