Pour commencer, prenez une aliquote de 75 microlitres contenant un milligramme de billes magnétiques enrobées de streptavidine liées à l’ADN et retirez le surnageant avec le support magnétique. Lavez les billes avec 200 microlitres de tampon de chargement. Ensuite, mettez les billes en suspension dans 75 microlitres de tampon de chargement et mélangez doucement par pipetage.
Ensuite, ajoutez le complexe de reconnaissance d’origine à une concentration finale de 37,5 nanomolaires à l’ADN lié aux billes et incubez la réaction pendant cinq minutes à 30 degrés Celsius avec une agitation de 800 tours par minute. Ajoutez CDC6 à une concentration finale de 50 nanomolaires et incubez la réaction comme démontré précédemment. Ajoutez ensuite Mcm2-7 Cdt1 à une concentration finale de 100 nanomolaires et incubez la réaction pendant 20 minutes comme démontré précédemment.
Après cela, ajoutez du DDK à une concentration finale de 100 nanomolaires et incubez de la même manière pendant 30 minutes. Après avoir retiré le surnageant, lavez l’ADN lié aux billes contenant des hexamères Mcm-2-7 phosphorylés avec 200 microlitres de tampon de lavage à haute teneur en sel. Mélanger par pipetage, en veillant à ce que les billes soient complètement remises en suspension.
Ensuite, retirez le tampon et lavez les billes une fois avec 200 microlitres de tampon CMG. Pour assembler et activer la CMG marquée par fluorescence sur de l’ADN lié à des billes, retirez le tampon CMG et remettez en suspension les billes liées à l’ADN dans 50 microlitres de tampon CMG complété par cinq millimolaires d’ADP. Ensuite, mélangez tous les composants mentionnés à l’écran dans un tube et placez-le sur de la glace.
Ajoutez immédiatement l’ADN lié aux billes en suspension au mélange de protéines. Incuber la réaction pendant 15 minutes à 30 degrés Celsius avec une agitation de 800 tr/min. Lavez le cordon séquentiellement avec un tampon HSW et un tampon CMG.
Après avoir retiré le tampon, remettez en suspension le CMG contenant des billes magnétiques liées à l’ADN dans 200 microlitres de tampon d’élution, puis incubez à température ambiante pendant une heure avec une agitation de 800 tr/min. Placez le tube dans une grille magnétique et laissez les perles être collectées pendant cinq minutes. Prélevez soigneusement le surnageant contenant les complexes ADN-CMG élués sans perturber les billes décantées et transférez-le dans un nouveau tube.
Pour s’assurer qu’il ne reste pas de billes dans la solution, placez à nouveau le surnageant collecté dans une grille magnétique et conservez-le soigneusement pendant cinq minutes supplémentaires. Récupérez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube. Ajoutez 1 400 microlitres de tampon CMG aux 200 microlitres de surnageant.
L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie d’une molécule unique.
