Pour commencer la transformation des cellules d’Escherichia coli BL21 DE3, décongelez 50 microlitres d’aliquote de suspension cellulaire compétente sur de la glace. Ajoutez un microlitre d’ADN du plasmide pET 28a Sumo TRF2 à la suspension cellulaire compétente et faites tourner doucement le tube pour mélanger la suspension. Après transformation, étalez 100 microlitres de suspension cellulaire sur une plaque de gélose luria bertani, ou LB, contenant 50 microgrammes par millilitre de kanamycine.
Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, choisissez une colonie de cellules transformées et cultivez-la dans cinq millilitres de milieu LB, complété par 50 microgrammes par millilitre de kanamycine. Incuber pendant 18 heures à 37 degrés Celsius, avec agitation à 220 tr/min.
Après l’incubation, induire la culture avec un IPTG millimolaire comme concentration finale. Incuber à 20 degrés Celsius pendant 17 heures pour favoriser l’expression des protéines. Chargez les extraits de protéines brutes, ainsi que le tampon de chargement, sur un gel SDS-PAGE.
Faites d’abord fonctionner les échantillons à 100 volts pendant 30 minutes, puis à 120 volts pendant 50 minutes dans un tampon de tris-glycine. Ensuite, colorez avec du bleu Coomassie pour visualiser l’expression des protéines. Pour la purification des protéines, centrifugez l’extrait de protéines brutes à 38 000 g pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius et filtrez le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre.
Chargez le surnageant filtré sur la colonne de nickel pré-équilibrée dans le tampon de liaison. Lavez la colonne avec un tampon de liaison et éluez la protéine avec le gradient d’imidazole préparé, en recueillant 12 fractions d’un millilitre chacune. Ajoutez du glycérol à une concentration finale de 50% à la protéine concentrée et tamponnée pour le stockage.
L’expression de TRF2 chez Escherichia coli a été démontrée avec succès, comme le montre SDS-PAGE, où des bandes distinctes correspondant à TRF2 sont apparues avant et après l’induction.
