Pour commencer, centrifugez une fois 10 à la puissance sept lignées cellulaires HeLa contenant des fragments d’ADN de restriction télomérique à 1 000 g pendant trois minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de PBS. Après le traitement à la protéinase K SDS et au chlorure de sodium, centrifugez la suspension cellulaire à 16, 900 g pendant 10 minutes.
Transférez le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger et ajoutez un volume égal d’isopropanol, en évitant les lipides ou les sédiments flottants. Centrifugez à grande vitesse et lavez le granulé avec 500 microlitres d’éthanol à 70%. Après avoir séché la pastille d’ADN, remettez-la soigneusement en suspension dans 475 microlitres de tampon TE et mélangez doucement en tapotant le fond du tube.
Maintenant, ajoutez 25 microlitres de 10 milligrammes par millilitre d’ARN et tapotez le tube jusqu’à ce que la pastille soit complètement dissoute. Ensuite, ajoutez 1/10 volume d’acétate de sodium à trois molaires et deux volumes d’éthanol froid à 100 % et placez le tube à moins 80 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Après la centrifugation et le lavage à 70 % d’éthanol, ajoutez 100 microlitres de tampon TE à la pastille d’ADN, tapotez le tube pour mélanger et placez-le à quatre degrés Celsius pendant deux heures pour le dissoudre complètement.
Pour la digestion de l’ADN, combinez quatre microgrammes d’ADN génomique avec un microlitre de CviAII, deux microlitres de tampon de digestion 10X et de l’eau pour atteindre un volume total de 20 microlitres. Incuber le mélange à 25 degrés Celsius pendant 12 heures. Dans un thermocycleur, chauffez le mélange à 75 degrés Celsius pendant trois minutes.
Ensuite, diminuez la température de 0,1 degré Celsius toutes les 30 secondes jusqu’à ce qu’elle atteigne 25 degrés Celsius. Après le nettoyage et le séchage, enduire les lamelles inférieures de 20 microlitres de nitrocellulose à 0,1 % et ajouter des billes de référence. Faites cuire les lamelles de recouvrement à 100 degrés Celsius pendant quatre minutes.
Assemblez le sandwich de cellules d’écoulement. Et après avoir chauffé à 85 degrés Celsius, utilisez deux cotons-tiges pour masser l’ensemble jusqu’à ce que le Parafilm scelle le canal. Lavez cinq fois 10 microlitres de billes M-270 avec 50 microlitres de tampon de travail à l’aide d’un aimant.
Après le lavage, ajoutez les billes sur l’ADN génomique digéré dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Agitez doucement le tube plusieurs fois pour mélanger les perles et l’échantillon d’ADN. Laissez le mélange sur de la glace pendant une heure.
Après l’incubation, lavez le mélange avec 500 microlitres de tampon de travail trois fois à l’aide d’un aimant pour tirer les billes vers le bas avec des intervalles de 10 minutes entre les lavages. Remettez l’échantillon en suspension dans un tampon de travail et chargez 30 microlitres du mélange dans la cellule d’écoulement. Rincez les billes magnétiques déliées après 30 minutes.
Après avoir placé la cellule d’écoulement sur le dessus de la lentille de l’objectif, sélectionnez une paire d’aimants cubiques de cinq millimètres disposés dans une configuration verticale et alignez le support d’aimant avec l’axe x du chemin lumineux de la pince magnétique pour l’imagerie. Lancez le logiciel de programmation graphique et connectez les contrôleurs pour la pince à épiler magnétique. Ajustez le champ de vision pour localiser une perle de référence au bas de la cellule d’écoulement et ajustez légèrement la lentille de l’objectif de sorte que la perle de référence présente des anneaux de défraction clairs.
Écrivez un script dans MATLAB pour contrôler les mouvements du moteur pour les tests de rampe de force. Importez le script dans un logiciel de programmation graphique pour tester les expériences sur une molécule unique. À un débit lent, chargez 200 microlitres de TRF1 de 10 nanomolaires dans la cellule d’écoulement.
Après 30 minutes de liaison, choisissez un script pour une expérience de rampe de force avec un taux de charge de force de plus/moins un piconewton par seconde. Nommez les fichiers de données et exécutez l’expérience. L’intégrité de l’ADN génomique a été confirmée à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose, le TRS résultant affichant des longueurs constantes dans diverses lignées cellulaires humaines.
Des séquences de répétition télomériques dans la TRS ont été détectées par transfert de Southern, montrant des signaux d’hybridation clairs. Les courbes d’extension de force de l’essai de rampe de force ont montré des motifs en zigzag pendant l’étirement, indiquant la rupture des interactions protéine-ADN. La cinétique de dissociation des complexes protéiques d’ADN télomérique a montré une relation linéaire entre la force et le taux de dissociation.
De plus, l’hétérogénéité de longueur de l’ADN télomérique des cellules humaines étudie le mécanisme de formation de boucles dans des télomères de différentes longueurs.
