Pour commencer, disposez le tampon de blocage stérilisé du filtre fraîchement préparé, le tampon de réaction 10X un et deux sur une plate-forme de travail. Placez des tubes ouverts contenant 2,5 millilitres de tampon de blocage et cinq millilitres d’eau ultrapure dans un dessiccateur et dégazez sous vide. Après 15 minutes, relâchez la pression et retirez les tubes.
Placez l’ensemble de cellules d’écoulement biotine-PEG préparé sur une platine de microscope et fixez-le à l’aide d’un mastic adhésif à chaque extrémité. Connectez le tube de sortie de la cellule d’écoulement au pousse-seringue à l’aide d’une aiguille. Allumez le chauffage de l’objectif à 30 degrés Celsius.
Fixez un à deux millilitres d’eau dégazée dans un tube à un morceau de mastic adhésif séparé près de la cellule d’écoulement. Insérez le tube d’entrée dans le tube jusqu’à ce qu’il atteigne le fond et faites couler l’eau à travers le canal. Augmentez le débit pour éliminer les bulles piégées près du tube d’entrée.
Ajouter 100 microlitres de tampon de blocage dégazé à une aliquote de 20 microlitres d’un milligramme par millilitre de streptavidine. Fixez le tube ouvert sur du mastic adhésif. Transférez le tube d’entrée de l’eau à la streptavidine et commencez l’écoulement à un débit de 40 microlitres par minute pendant deux minutes.
Après cinq minutes, lavez l’excès de streptavidine avec le tampon de blocage. Flux d’ADN biotinylé dilué dans un tampon bloquant contenant 25 nanomolaires SYTOX Orange. Image en direct avec le laser de 532 nanomètres pour observer l’ADN se connecter à la surface en temps réel.
Une fois que la densité souhaitée d’ADN à la surface est atteinte, faites couler dans un tampon de blocage contenant 25 nanomolaires de SYTOX pour éliminer l’ADN libre. Maintenant, l’anticorps anti-digoxigénine dilué dans un tampon bloquant contenant 25 nanomolaires SYTOX Orange. Éliminez l’anticorps anti-digoxigénine biotinylé et SYTOX Orange avec un tampon bloquant.
Écoulez 50 microlitres d’ATP-gamma-S dans la cellule d’écoulement. Ajouter de l’hélicase CMG purifiée à environ 100 concentrations finales nanomolaires dans 30 microlitres de mélange ATP-gamma-S et un écoulement à 20 microlitres par minute pendant 20 microlitres. Incuber pendant 15 minutes.
Ensuite, versez un mélange ATP RPA à 40 microlitres par minute pour 80 microlitres. À l’aide de chaque laser avec une exposition de 50 à 100 millisecondes, visualisez et acquérez EGFP RPA avec un laser de 488 nanomètres, puis acquérez CMG avec un laser de 640 nanomètres. Enfin, visualisez et acquérez de l’ADN coloré à l’orange SYTOX à l’aide d’un laser de 532 nanomètres.
Le déroulement hélicase de l’ADN de CMG a été visualisé par la croissance linéaire de l’APR jaune suivie au fil du temps, indiquant les brins d’ADN déroulés. Les dommages à l’ADN simple brin ont réduit le nombre d’événements de déroulement réussis observés, comme le démontre la diminution du nombre de traces complètes dans les données.
