Pour commencer, lavez les graines certifiées de Pinus pinaster dans l’eau courante du robinet pour enlever les plus gros débris. Lavez ensuite les débris les plus fins à l’aide d’une solution détergente courante avec une agitation vigoureuse. Dans une hotte à flux, ajoutez une solution d’eau de Javel commerciale jusqu’à ce que les graines soient couvertes et mélangez vigoureusement pendant 15 minutes.
Après avoir jeté la solution d’eau de Javel, rincez les graines trois fois avec de l’eau du robinet stérilisée. Plongez maintenant les graines dans de l’éthanol à 80% pendant 15 minutes avec une agitation vigoureuse. Après avoir éliminé l’éthanol, lavez les graines trois fois avec de l’eau ultrapure stérilisée.
Pour la germination du pin, cassez les témentages stérilisés avec un tour mécanique stérile. Isolez les pignons de pin et placez-les dans un récipient fermé avec du papier filtre humide stérilisé pour les hydrater pendant la nuit. Le lendemain, stratifiez les pignons de pin hydratés à quatre degrés Celsius pendant sept jours pour rompre la dormance et synchroniser la germination.
Maintenez ensuite les pignons de pin dans l’obscurité à 25 degrés Celsius jusqu’à la germination. Transférez les pins germés aseptiques dans des conditions environnementales contrôlées pendant deux semaines, ou jusqu’à ce que la tige principale commence à se développer. Après deux semaines, coupez la partie aérienne du plant au-dessus de la racine à l’aide d’un scalpel et transférez-la dans un milieu de culture Schenk Hildebrandt stérilisé.
Maintenir la culture dans des conditions environnementales contrôlées telles que décrites précédemment. Sous-culture périodique en coupant le tissu calleux à la base de la pousse avec un scalpel stérile. Transférez la grappe de pousses à l’aide d’une pince à épiler stérile dans un milieu de culture de multiplication frais.
Ensuite, inoculez les micropousses dans le milieu de culture Schenk Hildebrandt contenant trois grammes par litre de charbon actif pour l’allongement des microtiges. Placez maintenant les pousses allongées dans le milieu de culture Schenk Hildebrandt sans phytohormones ni charbon actif. Ajouter 100 à 150 nématodes du pin stérilisés à des stades de vie mixtes au bas de la micropousse.
Maintenir la culture dans des conditions environnementales contrôlées telles que décrites précédemment. L’établissement et l’infection des pousses de pin in vitro ont montré l’apparition d’aiguilles chlorotiques dans le mois suivant la co-culture avec les nématodes du pin.
