Pour commencer, placez les images d’yeux de mouche de drosophile saines et dégénérées dans le même dossier. Assurez-vous que les fichiers sont nommés de manière appropriée pour identifier les groupes expérimentaux et faire la distinction entre les mâles et les femelles. Ouvrez le logiciel Ilastik.
Cliquez sur Créer un nouveau projet. Ensuite, dans Autres flux de travail, sélectionnez Comptage de la densité de cellules et sélectionnez un emplacement pour enregistrer le fichier de projet. Séquentiellement, cliquez sur 1.
Entrez des données, Ajouter un nouveau et Ajouter des images distinctes pour choisir l’image standard. Cliquez ensuite sur 2. Sélection de fonctionnalités et sélectionnez les fonctionnalités.
Choisissez plus de valeurs sigma pour augmenter la sensibilité. Cliquez sur 3. Compter et régler la valeur sigma de premier plan sur 5,00.
À l’aide de l’outil de premier plan, marquez au moins 50 ommatidies individuelles sur l’image standard. Cliquez sur 3. Comptez à nouveau et utilisez l’outil d’arrière-plan pour marquer la zone à l’extérieur des ommatidies.
Tracez des lignes vertes en forme de treillis autour des ommatidies. Cliquez sur 4. Exportation de densité et choisissez Exporter les paramètres d’image pour ajuster les paramètres d’image.
Cliquez ensuite sur Output File Info et sélectionnez le format tiff pour une analyse plus approfondie dans Flynotyper. Cliquez sur 5. Traitement par lots, sélectionnez les fichiers de données brutes et sélectionnez toutes les photos expérimentales à analyser.
La liste des images importées à analyser s’affiche sous Sélectionner les fichiers de données brutes. Cliquez sur Traiter tous les fichiers en bas de la section 5. Section Traitement par lots.
Une fois le traitement du logiciel terminé, vérifiez le dossier contenant les images expérimentales des yeux de mouche. Vérifiez que les images noires nommées, les probabilités de nom de votre échantillon, sont présentes. Dans ImageJ, ouvrez le fichier tiff généré par Ilastik.
Utilisez l’outil de sélection de rectangle pour faire un rectangle autour de l’œil. Sélectionnez Ctrl X ou Ctrl C pour recadrer la zone et attendre qu’une boîte noire en forme de contour rectangulaire apparaisse. Séquentiellement, cliquez sur Fichier, Nouveau et Presse-papiers interne pour ouvrir l’œil de mouche recadré.
Pour enregistrer l’œil de mouche coupé au format JPEG, cliquez sur Fichier, Enregistrer sous et JPEG. Dans ImageJ, cliquez sur Plugins, et Flynotyper. Sous Génotypes, sélectionnez Ajouter des génotypes et ouvrez le dossier contenant les images d’œil de mouche coupées.
Cochez les cases Microscope optique et Verticalement. Ensuite, sous Classer les ommatidies par, cochez les cases Stabilité et Distance par rapport au centre. Pour le nombre d’ommatidies classées considérées, définissez l’entrée sur 200.
Cliquez sur Exécuter et attendez que les résultats de l’analyse s’affichent. Copiez et collez le fichier d’échantillon et le P-score dans un logiciel statistique pour une analyse plus approfondie. Les images oculaires de drosophile traitées avec Ilastik et analysées sous lumière annulaire ont montré des motifs ommatidiens plus clairs par rapport à ceux sans lumière annulaire, améliorant ainsi l’évaluation qualitative.
L’analyse de Flynotyper a indiqué des scores phénotypiques significativement plus élevés dans les yeux de mouche modérément et sévèrement dégénérés par rapport aux yeux non dégénérés. Lorsque Ilastik n’a pas été utilisé, les scores P entre les yeux non dégénérés et les yeux modérément dégénérés étaient similaires.
