Pour commencer, préparez une chambre humidifiée en prenant une grande boîte à diapositives et en retirant le couvercle en carton collé au couvercle. Placez les serviettes en papier humides verticalement à la base de la boîte à glissières, en vous assurant qu’elles sont à plat. Préparez la lame pour la coloration par déparaffinisation, réhydratation, récupération d’antigène et lavage.
Retirez la lame du PBS et essuyez l’excès de PBS tout en évitant le tissu. À l’aide d’un stylo hydrophobe, dessinez une boîte autour du tissu pour former une barrière. Placez la glissière de contour horizontalement sur les serviettes en papier humides.
Ajoutez environ 100 microlitres de tampon de blocage pour couvrir le tissu. Fermez la chambre humidifiée et incubez les lames à température ambiante pendant 90 minutes. Ensuite, tapotez doucement la solution de blocage.
Ajoutez immédiatement le bloc souris sur souris préparé pour couvrir le tissu et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, retirez les lames de la chambre humidifiée et placez-les directement dans un support à lames immergé dans du PBS. Ensuite, retirez les diapositives de PBS.
Tapotez doucement l’excès de PBS et replacez-le horizontalement dans la chambre humidifiée. Ajoutez des anticorps primaires d’intérêt suffisamment dilués pour couvrir le tissu. Une fois les lames retirées de la chambre humidifiée, tapotez doucement les anticorps primaires et placez les lames dans un support à lames immergé dans du PBS pendant cinq minutes.
Après avoir retiré les lames du PBS et tapoté l’excès de PBS, remettez-les horizontalement dans la chambre humidifiée. Ajoutez des fluorophores d’anticorps secondaires suffisamment dilués ou des anticorps primaires conjugués d’intérêt pour couvrir le tissu. Ensuite, ajoutez du Huist suffisamment dilué directement sur le tissu avant de l’incuber à température ambiante dans l’obscurité.
Après cela, placez les lames dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli de PBS pendant cinq minutes dans l’obscurité. Retirez une diapositive à la fois, en gardant les lames restantes immergées dans le PBS dans l’obscurité. Après avoir retiré l’excès de PBS, ajoutez une à deux gouttes de produit de montage anti-décoloration au centre du tissu.
Tenez un couvercle propre par les bords et abaissez-le lentement sur le toboggan à un angle de 45 degrés. En commençant par le centre du tissu, appuyez doucement sur la lamelle avec deux doigts. Fixez une pipette P200 coupée et non filtrée à l’extrémité d’une pipette sérologique connectée à un vide.
En suivant les bords de la lamelle, utilisez l’aspirateur pour retirer l’excès de support de montage. Dans une nouvelle boîte à diapositives, posez horizontalement la diapositive à plat avant de la laisser sécher dans l’obscurité à température ambiante. Des images microscopiques ont montré la morphologie de différents segments intestinaux et la coloration des cellules caliciformes.
La membrane apicale, la membrane latérale des cellules épithéliales et les noyaux. La coloration immunofluorescente de l’intestin a mis en évidence de nombreux compartiments cellulaires différents, y compris les cellules prolifératives, l’interstitium, le domaine lysosomal et l’épithélium.
