Pour commencer, cultivez le tissu cérébelleux haché récupéré sur un bébé souris de 10 jours dans un aigle moyen basal. Ajoutez des produits chimiques endommageant l’ADN directement dans le milieu de culture à des concentrations finales appropriées. Après la période d’exposition, remplacez le milieu par un milieu mixte fraîchement préparé contenant les produits chimiques endommageant l’ADN et l’inhibiteur de la poly ADP ribose glycohydrolase, et incubez pendant 30 minutes.
Après 30 minutes, lavez les tranches avec un tampon de phosphate 0,1 molaire à température ambiante et fixez-les immédiatement avec un mélange d’acétone et de méthanol pré-refroidi. Incuber l’assiette pendant 20 minutes à moins 20 degrés Celsius. Retirez ensuite la solution de fixation et lavez-la avec un tampon de phosphate 0,4 molaire.
Ajouter 100 microlitres de tampon phosphate 0,1 molaire dans chaque puits d’une plaque de 48 puits. Ensuite, à l’aide d’un scalpel et d’une planche à découper, vous pouvez retirer les marges de l’insert, en coupant autour de la tranche de tissu. Placez la tranche dans un puits de la plaque à 48 puits.
Après avoir aspiré le tampon, incubez l’insert avec 100 microlitres de tampon phosphate 0,1 molaire contenant 1% de Triton X100. Aspirez la solution et incubez en série l’insert dans chaque puits sur un agitateur avec des quantités appropriées de solution bloquante suivie de la primaire dans les anticorps secondaires. Ajoutez 20 microlitres de la solution finale de DAPI dans chaque puits 20 minutes avant la fin de l’incubation de deux heures avec l’anticorps secondaire et continuez à agiter pendant 20 minutes.
Pour le montage, placez le tissu sur une lame de verre de microscope avec le tissu vers le haut. Ajoutez le support de montage et couvrez avec un verre de protection. Placez les lames sur une surface plane et laissez-les sécher toute la nuit dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.
La foliation cérébelleuse a été maintenue dans la culture. Les cellules de Purkinje ont été colorées pour la calbindine D-28K et les noyaux neuraux colorés pour le NeuN. Les astrocytes des cellules de Purkinje ont été colorés pour le GFAP.
La coloration au PAR a augmenté dans les cellules de Purkinje traitées après une exposition au bromate de potassium et au paraquat, indiquant des dommages à l’ADN.
