Pour isoler les mitochondries, placez le rat décapité anesthésié en position couchée sur de la glace. Après avoir exposé le cœur, coupez l’aorte à environ quatre à six millimètres au-dessus de la racine aortique et en dessous des points de ramification carotidienne. Canulez l’aorte et perfuser le cœur avec une solution glacée de cardioplégie à l’aide d’une tête de pression dépendante de la gravité jusqu’à ce que les artères coronaires soient débarrassées du sang et que l’organe apparaisse blanchi.
Disséquez les oreillettes, le tissu valvulaire cartilagineux et les tissus adipeux pour isoler le myocarde ventriculaire. Hachez le tissu avec des ciseaux chirurgicaux tranchants jusqu’à ce que les morceaux mesurent environ un millimètre cube. Transférez le tissu haché dans le tube à centrifuger pré-refroidi, étiqueté spins un et deux contenant la solution de protéase.
Ajoutez un tampon d’isolement glacé à un volume final de 25 millilitres. À l’aide d’un homogénéisateur de stator à rotor portatif motorisé, dispersez le tissu à 18 000 tr/min sur de la glace pendant 20 à 25 secondes. Centrifuger le tissu homogénéisé à 8 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez le surnageant. Et rincez doucement la pastille avec cinq millilitres de tampon d’isolement pour éliminer la protéase résiduelle. Après avoir jeté le rinçage, ajoutez un tampon d’isolement glacé à un volume final de 25 millilitres.
Puis vortex pour remettre la pastille en suspension. Centrifuger l’homogénat de tissu à 800 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Versez doucement le surnageant contenant des mitochondries dans un tube de 50 millilitres pré-refroidi étiqueté.
Centrifugez maintenant le surnageant à 8 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et conservez les mitochondries contenant la pastille. À l’aide d’une lingette non pelucheuse, absorbez l’excès de surnageant de la paroi intérieure du tube sans déranger la pastille et placez le tube sur de la glace.
Ajoutez 80 microlitres de tampon d’isolement glacé au fond du tube et résuspendez doucement les mitochondries à l’aide d’une micro-pipette. Une fois remises en suspension, transférez les mitochondries dans un microtube à centrifuger étiqueté pré-refroidi. Déterminer la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du dosage des protéines d’acide cinétique du bison.
Dans un microtube de centrifugation pré-refroidi, diluez le stock mitochondrial à la concentration de travail souhaitée avec un tampon d’isolement. Pour tester la viabilité et la qualité des isolats mitochondriaux, chargez 2,3 millilitres de tampon respiratoire dans les chambres Oxygraph. Laissez le signal de consommation d’oxygène s’équilibrer à 37 degrés Celsius pendant environ 10 minutes ou jusqu’à ce que le taux soit proche de zéro.
Lors de l’équilibrage, abaissez les bouchons et aspirez l’excédent de tampon. À l’aide d’une seringue Hamilton de 10 microlitres, ajoutez un millimolaire d’EGTA pour chélater tout calcium résiduel dans le tampon respiratoire de l’Oxygraph. Pour alimenter la respiration, ajoutez cinq millimolaires de pyruvate de sodium et un millimolaire d’al-malate dans le tampon.
Ajoutez ensuite un bolus de mitochondries diluées et laissez la respiration se produire pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, ajoutez un bolus de 500 micromolaires d’ADP pour initier l’état de respiration trois. Pour calculer le rapport de contrôle respiratoire, divisez le taux maximal de consommation d’oxygène pendant l’état trois par le taux de consommation d’oxygène juste avant l’ajout de l’ADP dans l’état deux.
Une augmentation rapide de la consommation d’oxygène a été observée immédiatement après l’ajout d’ADP, indiquant une initiation réussie de la phosphorylation oxydative dans les mitochondries cardiaques isolées. Les mitochondries cardiaques de cobayes, de rats Sprague-Dawley et de souris du virus B de la leucémie Friend ont montré des rapports de contrôle respiratoire élevés, indiquant une bonne qualité d’isolement mitochondrial. Les mitochondries hépatiques et rénales des rats Sprague-Dawley ont également montré des rapports de contrôle respiratoire acceptables favorisant une isolation réussie.
Les cellules HEK293 ont présenté des valeurs de rapport de contrôle respiratoire supérieures au seuil acceptable, confirmant la qualité de l’isolement mitochondrial de ces cellules.
