Pour configurer le test cinétique pour les peptides RBPR2 et STRA6, diluez en série les peptides RBPR2, RBPR2 mutants et STRA6 de souris dans un tampon en cours d’exécution. Ouvrez le logiciel de contrôle et sélectionnez l’assistant Kinetic SOAR Affinity. Dans la boîte de dialogue de séquence d’injection, sélectionnez Chemin d’écoulement 2.1 avec la cellule d’écoulement 2 comme active et la cellule d’écoulement 1 comme référence.
Dans la boîte de dialogue de configuration, cochez l’option Exécuter les cycles de démarrage, saisissez la solution sous forme de tampon, spécifiez le nombre de cycles et cliquez sur Suivant. Allez maintenant dans la boîte de dialogue des paramètres d’injection et entrez les paramètres de l’échantillon tels que le temps de contact de 120 secondes, le débit de 30 microlitres par minute et le temps de dissociation de 300 secondes. Pour les paramètres de régénération, réglez la solution de régénération sur l’acide chlorhydrique glycine avec un temps de contact de 30 secondes et un débit de 30 microlitres par minute, puis cliquez sur suivant.
Dans la boîte de dialogue des échantillons, entrez les noms des peptides, les poids moléculaires et les concentrations, puis cliquez sur Suivant. Dans la boîte de dialogue de position du rack, attribuez les peptides dilués sous forme d’échantillons individuels de 120 microlitres avec différentes concentrations de un à 100 micromolaires aux positions désignées sur le rack. Cliquez sur éjecter le rack et insérez tous les flacons.
Ensuite, cliquez sur Suivant, puis dans la boîte de dialogue de préparation du protocole d’exécution, cliquez sur Démarrer. Entrez un nom de fichier et cliquez sur Enregistrer. Maintenant, dans le logiciel, cliquez sur le menu Démarrer et sélectionnez une évaluation.
Ouvrez le fichier, puis, dans le menu déroulant de sélection, choisissez FC-2.1 pour analyser le sensorgramme actif de référence pour les phases d’association et de dissociation des peptides msRBP4, msRBPR2 mutants et msSTRA6. Ensuite, cliquez sur le bouton déroulant Cinétique ou Affinité et choisissez Lié à la surface. Dans la boîte de dialogue de sélection des courbes, cochez la case Inclure la colonne dans le tableau, puis cliquez sur Suivant.
Allez maintenant dans la boîte de dialogue de sélection des données, affichez les captages vierges soustraits. Cliquez sur Cinétique et affinité. Conservez les paramètres par défaut et cliquez sur Ajuster pour l’ajustement de la courbe.
Examinez l’onglet du rapport pour trouver la constante de dissociation d’équilibre Kd, le taux d’association Ka ou Kon et le taux de dissociation Kd ou Koff. Enregistrez le sensorgramme de données Kinetics dans l’onglet de texte dans un format limité et utilisez les valeurs pour tracer des graphiques.
